實驗原理 ：

Southern Blot是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂 糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶 消化的DNA的片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA的片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜 或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量.

基本方法及主要步驟 ：
Southern印跡雜交的基本方法包括四部分，以下以植物southern印跡雜交為例。
　　（1）植物基因組DNA提?。?br />　?。?）DNA的限制性內(nèi)切酶 酶解、電泳和Southern轉(zhuǎn)移；
　　（3）探針的標(biāo)記和純化；
　?。?）雜交、洗膜、檢測以及去除膜上探針。

主要操作步驟 ：
　　1．瓊脂 糖電泳
　?。?）取一定量的待測DNA樣品，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切。DNA的量根據(jù)樣品的種類及實驗?zāi)康牡牟煌?，對于克隆片段的限制性?nèi)切酶圖譜分析，取0.1-0.5μg即可；而對于鑒定基因組DNA中的單拷貝基因序列，則需要10～20μg；當(dāng)采用寡核苷酸 探針或探針的比放射性活性較低時，則需要30～50μg。
　?。?）酶切完畢，在瓊脂糖凝膠中電泳。
　?。?）電泳結(jié)束后，EB染色，長波紫外線下觀察電泳結(jié)果及照相。
　　2．印跡轉(zhuǎn)移
　?。?）切膠并作標(biāo)記（左下角切除），以便于定位，然后將凝膠置于一容器中。
　　Southern印跡雜交轉(zhuǎn)膜示意圖（2）將凝膠浸泡于適量的變性液中，室溫下放置1h 使之變性，不間斷地輕輕搖動。
　?。?）將凝膠用去離子水漂洗1次，然后浸泡于適量的中和液中30 min，不間斷地輕輕搖動。更換中和液，繼續(xù)浸泡15 min。
　　（4）將濾紙 ，硝酸纖維素膜 NC膜（以下簡稱NC膜）剪成與膠同樣大小，NC膜浸入轉(zhuǎn)移buffer中平衡30 min。
　?。?）按右圖操作：逐層鋪平，各層之間勿留有氣泡和皺折。
　?。?）虹吸轉(zhuǎn)移12-16h。
　　3．固定DNA
　?。?）取出轉(zhuǎn)移后的NC膜，用濾紙 吸干NC膜，NC膜光面朝上平鋪于變性液中變性5min。
　?。?）用相同的方法將NC膜平鋪在中性液上，中和兩遍，每遍5min。
　?。?）將膜夾在兩張干燥濾紙間，80℃烘烤1-2h。
　　4．預(yù)雜交
　　（1）將膜浸入5×SSC 中2min，將膜放入干凈的塑料袋中。
　?。?）將預(yù)雜交液事先在65℃ 預(yù)熱，然后將10 ml 預(yù)雜交液加入袋中，封口。
　?。?）65℃預(yù)雜交1h 以上，不時搖動。
　　5．雜交
　?。?）取出雜交袋，剪去一角去除雜交液后，加入5ml雜交液及5μl 變性探針，排除氣泡后封口。
　?。?）將雜交袋放入65℃ 水中雜交過夜。
　　6．按下列條件洗膜
　　2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室溫 5min /2次
　　0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2次
　　7．免疫酶聯(lián)檢測
　　（1）偶聯(lián)反應(yīng)
　?、儆弥泻鸵?洗膜2min，室溫。
　?、谟梅忾]液50ml洗膜30min，室溫，輕搖。
　?、塾弥泻鸵簩⑾♂尶贵w -Dig –Ap 至750 mU/ml ，將膜封入雜交袋，加入5 ml稀釋抗體 輕搖50min。
　　④用中和液 50 ml洗膜，10min ×2次，室溫，輕搖，除去未結(jié)合的抗體。
　?。?）顯色反應(yīng)
　?、儆闷胶庖?0 ml平衡膜2min。
　　②將膜裝入雜交袋中，加入5ml顯色液，避光30min 左右，當(dāng)出現(xiàn)顏色時不要晃動。
　?、塾肨E洗膜終止反應(yīng)。
　?、?0℃烤干。
主要應(yīng)用
　　1.遺傳病診斷
　　2.DNA圖譜分析
　　3.PCR產(chǎn)物分析