一些參考數(shù)據(jù) 

1.  電泳電壓和溫度的影響:為了使單鏈DNA保持一定的穩(wěn)定立體構(gòu)象，SSCP應(yīng)在較低溫 度下進(jìn)行（一般4 ℃-15 ℃之間）.在電泳過(guò)程中除環(huán)境溫度外，電壓過(guò)高也是引起溫度升高的主要原因，因此，在沒(méi)有冷卻裝置的電泳槽上進(jìn)行SSCP時(shí)，開始的5min應(yīng)用較高的電壓（250V），以后用100V左右電壓進(jìn)行電泳.這主要是由于開始的高電壓可以使不同立體構(gòu)象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會(huì)升高.隨后的低電壓電泳可以使之進(jìn)一步分離.在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件確定電泳電壓.

2.  靶DNA序列長(zhǎng)度的影響在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SSCP對(duì)短鏈DNA或RNA的點(diǎn)突變檢出率要比長(zhǎng)鏈的高，這可能是由于長(zhǎng)鏈DNA和RNA分子中單個(gè)堿基的改變?cè)诰S持立體構(gòu)象中起的作用較小的緣故.而有人認(rèn)為在DNA鏈較短的（400bp以下）情況下DNA的長(zhǎng)度不會(huì)影響SSCP 的效果.他們仔細(xì)選擇了實(shí)驗(yàn)條件，發(fā)現(xiàn)354 bp的DNA中點(diǎn)突變的檢出率仍可達(dá)到90%以上。

因?yàn)槟康钠卧介L(zhǎng)其單鏈的泳動(dòng)速度越慢，大于400 bp的目的片斷不但檢出率低而且泳動(dòng)速度極慢，所以建議樓主不要做sscp為好。
我們實(shí)驗(yàn)室的步驟如下 （在以上主要試驗(yàn)步驟做修改）：
pcr產(chǎn)物好了后，按1：1各10 ul得產(chǎn)物和變性上樣液，在pcr儀上95度變性5分鐘，要立即驟冷（準(zhǔn)備好的冰浴）10分鐘，加樣。恒功率20W，我們的槽子是25 cm的伯樂(lè)！一般200 bp，恒溫7度，5各小時(shí)就好了。（注意pcr產(chǎn)物一定要好，和maker中zui亮的一樣?。?/span>

我們?cè)囼?yàn)室做SNP用的是如下儀器： 

1.  PTC-200的PCR儀（擴(kuò)增、變性都用他）

2.  水平電泳槽（鑒定PCR產(chǎn)物）

3.  BIO-RAD universal mutation detection system 垂直電泳槽（變性后的產(chǎn)物檢測(cè)）

4.  恒溫水域器（保持電泳的溫度在4－6度）

5.  凝膠成像系統(tǒng)（GENE公司）

以上就是我們?cè)囼?yàn)的做SNP的儀器，別的小的儀器就不一一說(shuō)明了。

SSCP原理： 
sscp稱為單鏈構(gòu)象多態(tài)性，它是基于DNA構(gòu)象來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物單鏈堿基微小差異的方法，因其檢測(cè)敏感，快速和所需裝置簡(jiǎn)便而在分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但該方法的試驗(yàn)結(jié)果受多種因素的影響，如：PCR產(chǎn)物，溫度，電壓，PAGE膠的濃度和交聯(lián)度等，因而重復(fù)性比較差。因此在做SSCP時(shí)要注意各種條件的一致性。如果有酶切位點(diǎn)的話用RFLP方法檢測(cè)DNA 多態(tài)，或是用SSCP與RFLP兩種方法相結(jié)合，試驗(yàn)結(jié)果要更加可靠些。
SSCP的主要試驗(yàn)步驟： 

1.  PCR擴(kuò)增目的基因片段。

2.  制備PAGE（聚丙烯酰胺）膠。不同長(zhǎng)度的基因片段用不同濃度和交聯(lián)度的膠，常用 的有19：1，29：1，39：1（丙烯酰胺：甲叉），濃度有8％，10％，12％的。

3.  PAGE膠的灌制。將配好的PAGE膠混勻，立即灌至干凈的玻璃板中，插上梳子于室溫聚合1－2小時(shí)。

4.  PCR產(chǎn)物的變性及電泳。取1－2 ul PCR產(chǎn)物加5ul變性緩沖液，95度水浴或放置PCR儀上變性10分鐘，立即拿出冰浴，迅速上樣于非變性的PAGE膠，以1×TBE作緩沖液，在一定溫度下電泳。根據(jù)待測(cè)片段的長(zhǎng)度調(diào)整電壓和電泳時(shí)間。

5.  PAGE膠的染色。一般采用銀染的方法，具體方法很多，查查作這方面的文章就知道了?；旧习ㄈ旧?，顯色，停顯及觀察結(jié)果（判型）幾個(gè)步驟。

其中比較重要的是PAGE膠的交聯(lián)度和濃度的選擇，這要通過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)進(jìn)行比較，從而選擇*條件。另外溫度也要控制好，有的說(shuō)要在4度冰箱中跑電泳，但我們實(shí)驗(yàn)室的基本都是在室溫條件下跑電泳，結(jié)果也還可以。

說(shuō)明一下優(yōu)缺點(diǎn)： 

1.  變性，我們是95度10分鐘，和做PCR擴(kuò)增一樣。用PCR儀可以保證溫度、時(shí)間的準(zhǔn)確。如果用水域鍋，就要防止體系的揮發(fā)和變性溫度的準(zhǔn)確。

2.  做SNP一定要保證PCR產(chǎn)物的濃度好，所以當(dāng)然用瓊脂糖鑒定了。如果濃度夠，在變性鑒定時(shí)，單鏈濃度就更小，將導(dǎo)致無(wú)法鑒定！

3.  恒溫，做SNP要保持電泳槽恒溫，一般在4－6度。如果溫度高，對(duì)鑒定有影響。如溫度高，條帶跑的快，無(wú)法達(dá)到預(yù)期的單鏈和雙鏈分開！

這里在強(qiáng)調(diào)一下，如果有雙鏈無(wú)單鏈的情況下變性后的PCR產(chǎn)物一定要保證驟冷，防止復(fù)性，增加單鏈的濃度！以上是我做SNP的經(jīng)驗(yàn)，請(qǐng)大家指正！