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上海士鋒生物科技有限公司
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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測培養(yǎng)基 維生素檢測培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無菌檢測培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測培養(yǎng)基 化妝品檢測培養(yǎng)基 動物細胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗培養(yǎng)基 軍團菌檢測培養(yǎng)基 支原體檢測培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測培養(yǎng)基 弧菌檢測培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測培養(yǎng)基 檢測培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測培養(yǎng)基 細菌總數(shù)檢測,增菌培養(yǎng)基
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士鋒生物單克隆抗體技術(shù):克隆化方法講解

時間:2013/11/15閱讀:719
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 克隆化的方法很多,包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及熒光激活分離法等。 
 
(一)有限稀釋法 
1.材料 
(1)微量培養(yǎng)盤,盤內(nèi)各孔于克隆化前一天培養(yǎng)小鼠腹腔細胞(即飼養(yǎng)細胞)每孔2萬~4萬。 
(2)HT培養(yǎng)基 
2.操作方法 
(1)取出抗體陽性孔細胞,用HT培養(yǎng)液制成細胞懸液。并取樣進行臺盼蘭染色,計數(shù)。 
(2)用HT培養(yǎng)液將細胞稀釋成200個/ml、40個/ml、20個/ml和的懸液。 
(3)用吸管將細胞懸液分別種入微量培養(yǎng)盤,每孔0.05ml,細胞含量分別為10個/孔、2個/孔、1個/孔和0.5個/孔。 
(4)5%CO2飽和濕度,37℃培養(yǎng)。 
(5)每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況,選擇只有一個集落生長的孔,棄掉兩個以上和沒有細胞生長的孔。 
(6)克隆大量繁殖后,布滿孔底的1/3~1/2時,測培養(yǎng)液抗體。 
(7)抗體陽性孔細胞,移到有飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)瓶中,并傳2~4代就可以脫離飼養(yǎng)細胞,建成克隆株。 
 
(二)軟瓊脂克隆化 
借助撒在軟瓊脂上單個細胞定位生長,而達到克隆化,具體操作如下: 
1.配2.5%的瓊脂糖30ml,水浴溶化后,移入45℃水浴中。 
2.將117ml*DMEM液和3ml 10倍濃度的DMEM液混合,置45℃水浴預(yù)熱。 
3.將瓊脂糖與DMEM液混合,即為含0.5%瓊脂糖的*DMEM液,并加75×108 脾細胞。 
4.每塊平皿加10ml,于室溫中凝固。 
5.DMEM中的細胞與DMEM—瓊脂1:1混合,將細胞瓊脂混合物2ml鋪于凝固的平板上,使其全部覆蓋。 
6.放入CO2箱飽和濕度,37℃培養(yǎng)10天。 
7.用PBS配制0.6%瓊脂糖,于沸水浴溶解后,置45℃,在保溫情況下取一試管,迅速加入0.1ml 25%羊紅血球,0.2ml豚鼠補體,2.7ml 0.6%瓊脂糖。 
8.用3ml瓊脂糖—羊紅血球混合液覆蓋克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍,可篩選抗羊紅血球Ig。 
 
(三)顯微鏡操作法 
在直徑6cm培養(yǎng)皿中,加入1ml 1.0×108細胞懸液放置5%CO2飽和濕度,37℃溫箱中放置30min以上,倒置顯微鏡下,尋找那些與周圍相距甚遠的單個細胞,將毛細管口(一頭有直角彎頭毛細管,一頭連接一尺長乳膠管,用口控制液體進入)水平置放于液面上,左右微動,直到看見管口,對準(zhǔn)細胞,吸入毛細管,將管中細胞移到預(yù)先加有2.0×104~5.0×104飼養(yǎng)細胞96孔板內(nèi),培養(yǎng)后,即可獲得單個細胞形成的克隆。
 
(四)熒光激活分離法 
用一種熒光激活細胞分類器(Fluorescein Activafed Cell Sorter,F(xiàn)ACS)。其基本原理是:將細胞經(jīng)熒光抗體染色后,經(jīng)噴嘴形成單個細胞的線形液滴,在萊塞光激發(fā)下,熒光素發(fā)射熒光,此信號由光電倍增管接收,再結(jié)合細胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號,經(jīng)電腦處理,產(chǎn)生信號并與預(yù)定的信號對比,根據(jù)細胞熒光強度及細胞大小不同,將細胞分成不同級別,在電場中發(fā)生偏離,而分別收集于不同容器中。  

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