二、實(shí)驗(yàn)原理
聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳是以聚丙烯酰胺凝膠做支持物的一種區(qū)帶電泳，由于此種凝膠具有分子篩的性質(zhì)，所以本法對(duì)樣品的分離作用，不僅決定于樣品中各組分所帶凈電荷的多少，也與分子的大小有關(guān)。其次，聚丙烯酰胺凝膠電泳還有一種*的濃縮效應(yīng)，即在電泳開(kāi)始階段，由于不連續(xù)pH 梯度的作用，將樣品壓縮成一條狹窄區(qū)帶，從而提高了分離效果。
聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，很少帶有離子的側(cè)基，惰性好，電泳時(shí)，電滲作用小，幾乎無(wú)吸附作用，對(duì)熱穩(wěn)定，呈透明狀，易于觀察結(jié)果。
聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱(chēng)Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱(chēng)Bis)在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)而成的含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族大分子化合物。
三、儀器和試劑
儀器
電泳儀、垂直平板電泳槽、微量注射器、燈泡瓶、移液器、染色與脫色缸、量筒、滴管。
試劑
1. 丙烯酰胺(單體，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr)
2. 1%瓊脂
3. N，N，N，，N，—四甲基乙二胺(TEMED)
4. N，N，—亞甲基雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑，簡(jiǎn)稱(chēng)Bis)
5. 過(guò)硫酸銨(聚合時(shí)的催化劑)
6. 試劑A(pH8.9)：36.6g 三羥甲基氨基甲(Tris)和48mL 1mol/LHCl 混合加水至100mL
7. 試劑B(pH 6.7)：5.98g Tris 和48mL 1mol/LHCl 混合加水至100mL
8. 電極緩沖液：6.0gTris 和28.8g 混合加水至1000mL，用時(shí)稀釋10倍
9. 0.05%溴酚藍(lán)
10. 20%甘油
11. 7%醋酸
12. 1mol/LHCl
13. 蛋白樣品：人或動(dòng)物血清
四 、操作步驟
1.垂直平板電泳槽的安裝
先把垂直平板電泳槽和兩塊玻璃板洗凈，晾干。通過(guò)硅膠帶將兩塊玻璃板緊貼于電泳槽(玻璃板之間留有空隙)，兩邊用夾子夾住。將1%瓊脂糖融化，冷至50℃左右，用吸管吸取熱的1%瓊脂沿電泳槽的兩邊條內(nèi)側(cè)加入電泳槽的底槽中，封住縫隙，冷后瓊脂凝固，待用。
2.凝膠的制備
(1)分離膠的制備
稱(chēng)取Acr3.2g，Bis16mg，過(guò)硫酸銨16mg 一起置于燈泡瓶中，然后加入試劑A2mL，水14mL，搖勻，使其溶解，然后用真空泵抽氣10min，以防止分離膠中的氧氣妨礙膠的聚合，隨后再加TEMED2滴(滴管內(nèi)徑小于2mm)，混勻。用吸管吸取分離膠，沿壁加入垂直平板電泳槽中，直至膠液的高度達(dá)電泳槽高度的2/3左右，上面再覆蓋一層水或正丁醇(防止氧氣擴(kuò)散進(jìn)入凝膠抑制聚合)，室溫下靜置約1h 即可聚合。(注意：丙烯酰胺有毒，應(yīng)避免皮膚直接接觸。)
(2)濃縮膠的制備
稱(chēng)取Acr0.12g，Bis6mg，過(guò)硫酸銨16mg，試劑B0.4mL，水2.8mL，搖勻后抽氣10min，加TEMED1滴，混勻。用吸管吸取濃縮膠加到分離膠的上面，直至膠的高度為1.5cm，這時(shí)將梳板插入，注意梳齒邊緣不能帶入氣泡，室溫下靜置約0.5～1h 即可聚合。觀察梳齒附近凝膠中呈現(xiàn)光線(xiàn)折射的波紋時(shí)，濃縮膠即凝聚完成。將梳子拔出后，用電極緩沖液沖洗梳孔。
(3)加樣
用微量注射器分別吸取10mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品50ul，上面加20%甘油1滴，溴酚藍(lán)指示劑1滴，再用滴管小心加入少量電極緩沖液使之充滿(mǎn)梳孔。
(4)電泳
將電極緩沖液分別倒入上下電泳槽，接通電源，調(diào)節(jié)電壓為300V，待溴酚藍(lán)移至凝膠底部1～1.5cm時(shí)，切斷電源。
(5)染色
將凝膠從玻璃板上取下，放入染色缸中染色20～30min，然后放入7%醋酸中脫色至背景脫盡為止。
(6)鑒定
根據(jù)染色所出現(xiàn)的區(qū)帶，分析樣品的純度。