1.貼壁細胞 ,讓細胞自己在蓋玻片上爬片。操作如下:
A. 取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡5分鐘或更長時間,無菌超凈臺內吹干或用細胞培養(yǎng)PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌三遍,再用細胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內,種入細胞培養(yǎng)過夜,使約為50%-80%滿。
B. 刺激細胞發(fā)生凋亡后,吸盡培養(yǎng)液,加入0.5ml固定液,固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。
C. 去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘,吸盡液體。洗滌時宜用搖床,或手動晃動數(shù)次。
D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分鐘。也宜用搖床,或手動晃動數(shù)次。
E. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。
F. 滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上,蓋上貼有細胞的蓋玻片,盡量避免氣泡。使細胞接觸封片液,切勿弄反。
G. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。
2. 懸浮細胞
A. 離心收集細胞樣品于1.5ml離心管內,加入0.5ml固定液,緩緩懸起細胞,固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。
B. 離心去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。洗滌期間手動晃動。
C. zui后一次離心后吸去大部分液體保留約50ml液體,再緩緩懸起細胞,滴加至載玻片上,盡量使細胞分布均勻。
D. 稍晾干,使細胞貼在載玻片上不易隨液體流動。
E. 均勻滴上0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體,微晾干。
F. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。
G. 滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上,蓋上一潔凈的蓋玻片,盡量避免氣泡。
H. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。