1、細(xì)胞培養(yǎng)所用溶液及其配制
1×RPMI1640及:按照產(chǎn)品說明配制,過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆谩?/em>
新生牛血清:56℃滅活30min,-20℃保存?zhèn)溆谩?/em>
2×104U/ml青、液(雙抗):青各2×106 U溶于100ml滅菌雙蒸水中,過濾除菌,分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?/em>
10×Na2EDTA-溶液(2.5%):Na2EDTA 0.2g,NaCl 8.0g,KCl 0.2g ,Na2HPO4.12H2O 2.89g,KH2PO4 0.2g,1%酚紅溶液1.5ml,(1:250)2.5g,溶于100ml雙蒸水中,NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2~7.5,過濾除菌,分裝,-20℃保存?zhèn)溆?,使用時1∶10倍稀釋。
7.5%NaHCO3: 7.5g NaHCO3溶于100ml雙蒸水中,115℃高壓滅菌15min,置4℃冰箱冷藏備用。
10% RPMI1640營養(yǎng)液:于1×RPMI1640溶液中加入10%小牛血清,按照1% 比例加入2×104U/ml雙抗,用7.5% NaHCO3或10% HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.4。
2、將50日齡的SPF仔豬放血,結(jié)扎氣管后無菌摘取其肺臟,先用0.9%的生理鹽水洗滌外表面,將pH7.2的PBS30.0ml從氣管灌入肺臟,輕輕拍打肺表面,1~2min后回收灌洗液,如此反復(fù)進(jìn)行,直至灌洗液清亮為止。將回收的支氣管肺泡灌洗液用吸管輕輕吹打,將細(xì)胞團(tuán)塊打散,用單層無菌100目不銹鋼篩過濾,收集全部灌洗液,2000r/min離心10min,收集沉淀。洗滌兩次后加入適量含10%胎牛血清的1×RPMI1640營養(yǎng)液吹散細(xì)胞,置培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中于37?C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待其貼壁后棄去上清及非黏附細(xì)胞繼續(xù)用含10%胎牛血清的1×RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)備用。