原代培養(yǎng)
1.取新生3d以內(nèi)BALB/c小鼠,斷頸處死后立即投入75%酒精中消毒5min(雖有頭部皮膚保護,但時間不要過長,所以事先要把準備工作做好之后再去殺老鼠)。
2.D-Hank’s液漂洗后分離顱蓋骨,刮除骨膜和結(jié)締組織,DMEM清洗顱骨骨片并剪碎。(自我感覺碎一點好一些)
3.加入0.25%(含0.02EDTA),37°恒溫消化20min,吸出消化液,之后1mg/1mlI型膠原酶37°恒溫消化20min后離心(1000r/min,5min),棄上清液。(消化時間自己摸索,之前我消化30分鐘,但zui后發(fā)現(xiàn)消化30min后懸浮未貼壁細胞較多,于是降低了消化時間,增加了膠原酶消化時間),
4.加入含15%血清的DMEN培養(yǎng)基,吹打骨片(力氣不要過大,但要吹打次數(shù)多一下,盡量使細胞從松解得骨片上脫落),將細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中,置于37℃ CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)。
傳代培養(yǎng)步驟
1.棄除舊的培養(yǎng)液(可以吸,可以倒,倒的時候小心)
2.用PBS沖洗一遍(加PBS清洗或換液時,主要反拿培養(yǎng)瓶加液,不要將細胞沖刷下來)
3.用0.25%的消化液消化30-45s,在顯微鏡下觀察,細部變圓,間距增大時,可用手拍打瓶側(cè)壁與底壁,會發(fā)現(xiàn)細胞很快懸?。ㄈ绻拇虻脑?,下一步注意千萬不要棄去消化液,如果不拍打,可以棄去)
4.加入含15%的牛血清培養(yǎng)液終止消化
5.用吸管反復細心吹打瓶底,置離心管中后,可以用PBS或D-HANKS再吹打,可以反復幾次,目的是將細胞盡可能的洗刷干凈(用PBS或D-HANKS目的是省錢,呵呵培養(yǎng)基也可以,不過money多,而且易產(chǎn)生氣泡)
6.離心