【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/em>
1.掌握聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦的基本原理
2.學(xué)習(xí)用等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的操作和方法
【實(shí)驗(yàn)原理】
等電聚焦法是一種特殊的聚丙烯酰胺凝膠電泳法。它的特點(diǎn)是在凝膠柱中加入兩性電解質(zhì)載體-Ampholine，從而使凝膠柱上產(chǎn)生pH梯度。當(dāng)向兩性載體凝膠施加電場時(shí)，即可形成pH梯度，pH梯度的順序是從陽極到陰極pH值逐漸增大。
蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，其所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量隨所處環(huán)境的pH而變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在等電聚焦凝膠柱中進(jìn)行電泳時(shí)，帶電荷的蛋白質(zhì)離子即在凝膠柱上泳動(dòng)：帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向陽極移動(dòng)，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子向陰極移動(dòng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品泳動(dòng)到凝膠的某一部位，這一部位的pH值正好相當(dāng)于該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷為零不再移動(dòng)，則聚焦形成一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。這種按等電點(diǎn)的大小在pH梯度某一相應(yīng)位置進(jìn)行聚焦的方法稱為等電聚焦。
利用這種方法，在蛋白質(zhì)聚焦的相應(yīng)位置測定凝膠的pH值，就可得知該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。
【實(shí)驗(yàn)材料】
1.實(shí)驗(yàn)器材
小玻璃管：內(nèi)徑0.5cm，長10cm 2支；小玻管架；圓盤電泳槽；注射器和長針頭；移液管；pH計(jì)
2.實(shí)驗(yàn)試劑
(1) 兩性電解質(zhì)載體凝膠：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉雙丙烯酰胺0.1g，pH3一10的Ampholine 2.5ml，核黃素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。
(2) 蛋白質(zhì)溶液：純牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸餾水。此蛋白溶液應(yīng)無鹽離子。
(3) 5%磷酸溶液
(4) 2%氫氧化鈉溶液
(5) 考馬斯亮藍(lán)R-250染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。
(6) 40%蔗糖溶液
(7) 12%三氯醋酸溶液
(8) 脫色液：乙醇:冰醋酸:蒸餾水 = 25：10：65(v/v)。
【實(shí)驗(yàn)操作】
1. 取4ml兩性電解質(zhì)載體凝膠，置于抽氣瓶中，加入0.07ml蛋白質(zhì)溶液，輕輕搖動(dòng)混勻，抽去氣泡。
2. 取干凈的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3—4滴，然后吸取抽氣瓶中的兩性電解質(zhì)載體-蛋白質(zhì)混合液1.8ml緩緩放入玻璃管中，加入膠液后立即用注射器加上一薄層水（3-5mm高），使混合液表面與空氣隔絕。放置約0.5-1小時(shí)，觀察凝膠的凝聚情況。
3. 管內(nèi)凝膠凝聚后，用濾紙將頂端水吸去，小心拔去管底橡皮塞，讓蔗糖溶液流出，并用少量蒸餾水清洗，然后將小玻璃管垂直放入圓盤電泳槽中。上槽加入5%磷酸溶液，接正極，下槽加入2% NaOH溶液，接負(fù)極，于150V條件下進(jìn)行聚焦，過一段時(shí)間后（約2-3小時(shí)），電流穩(wěn)定不變時(shí)（基本為零），說明聚焦完畢。
4. 聚焦結(jié)束后取出小玻璃管，迅速用蒸餾水將兩端洗凈。用一帶長針頭的注射器灌滿蒸餾水，并將針頭緊貼玻璃管內(nèi)壁插至凝膠和管壁之間，轉(zhuǎn)動(dòng)玻璃管，同時(shí)推動(dòng)注射器，并使針頭在管壁與凝膠間前進(jìn)，注入蒸餾水，使凝膠膠條從玻璃管中脫出。
5. 將其中一根凝膠膠條浸于12%三氯醋酸溶液中固定2小時(shí)，白色蛋白區(qū)帶即出現(xiàn)。再浸于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色5小時(shí)。取出后，轉(zhuǎn)移至脫色液中脫去背景顏色。
6. 將另一根凝膠膠條按順序切成0.5cm長的小段，分別浸泡于1.0ml蒸餾水中過夜，用pH計(jì)測定pH值。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
以凝膠膠條長度為橫座標(biāo)，pH值為縱座標(biāo)，作圖。
量出染色的各蛋白區(qū)帶的距離，對照曲線查出其等電點(diǎn)。
【思考】
1. 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳法測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的原理？
2. 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳法操作時(shí)應(yīng)注意的問題？
