測(cè)序策略 
目前應(yīng)用的兩種快速序列測(cè)定技術(shù)是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學(xué)降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點(diǎn)，但卻隨機(jī)終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個(gè)堿基出現(xiàn)在可變終止端的機(jī)會(huì)均等，因些上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長(zhǎng)度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。然后在可以區(qū)分長(zhǎng)度僅差一個(gè)核苷酸的不同DNA分子的條件下，對(duì)各組寡核苷酸進(jìn)行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測(cè)序凝膠中若干個(gè)相鄰的泳道這上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。 
一Sanger雙脫氧鏈終止法 
Sanger法dna測(cè)序的試劑 
引物 
模板 
dna聚合酶 
放射性標(biāo)記的dNTP 
dNTP類(lèi)似物 
現(xiàn)行的邏終止法人加減法序列測(cè)定技術(shù)（Sacger和Coulson，1975）發(fā)展而來(lái)的。加減法引入了使用特異引物在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)、堿基特異性的鏈終止，以及采用聚丙烯酰胺凝膠區(qū)分長(zhǎng)度差一個(gè)核苷酸的單鏈DAN等3種方法。盡管有了這些進(jìn)展，但加減法仍然太不，也太不得法，因此難以廣為接受。直至引入雙氧核苷三磷酸（ddTBP）作為鏈終止劑（Sanger等，1977 ），酶法DNA序列測(cè)定技術(shù)才得到廣泛應(yīng)用。2’，3’ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們?cè)诿撗鹾颂堑?’ 位置缺少一個(gè)羥基。它們可以在DNA聚合酶作用下通過(guò)其5’ 三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長(zhǎng)的DNA鏈中，但由于沒(méi)有3’羥基，它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長(zhǎng)的DNA鏈不可能繼續(xù)延伸。這樣，在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后， 鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng)，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨(dú)立的酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)G或每一個(gè)T的位置上。 

Sanger法DNA測(cè)序的試劑 
1．引物 
酶促測(cè)序反應(yīng)中利用一個(gè)與模板鏈特定序列互補(bǔ)的合成寡核苷酸作為DNA合成的引物。在許多情況下，可將靶DNA片段克隆于M13噬菌體或噬菌粒載體，以取得單鏈DNA分子作為模板。但也可以采用Sanger 法商定變性雙鏈DNA模板的序列。在以上兩種情況下， 都可以采用能與位于靶DNA側(cè)翼的載體序列相退火的通用引物，而不必取得與未知DNA序列互補(bǔ)的引物。適于M13噬菌體重組克隆的通用測(cè)序引物一般長(zhǎng)15-29 個(gè)核苷酸，并可與緊靠M13mp18噬菌體多克隆位點(diǎn)區(qū)的HindⅢ位點(diǎn)成M13mp19 噬菌體多克隆位點(diǎn)區(qū)的EcoRI位點(diǎn)的序列互補(bǔ)。這些引物同樣也可用于對(duì)克隆于pUC質(zhì)粒的DNA進(jìn)行“雙鏈"測(cè)序，并可從許多廠(chǎng)商中購(gòu)置得到。此外，還有若干家公司出售一些引物，這些引物下為了對(duì)通過(guò)多種限制酶切位點(diǎn)克隆于不同質(zhì)粒的靶DNA進(jìn)行測(cè)序而設(shè)計(jì)的。 
2．模板 
如上所述，有兩類(lèi)DNA可以用作Sanger 法測(cè)序的模板：純單鏈DNA和經(jīng)過(guò)熱變性或堿變性的雙鏈DNA。采用通常從重組M13噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA應(yīng)中獲得數(shù)百個(gè)核苷酸的序列。如用變性雙鏈DNA用模板，則較難獲得這咱質(zhì)量的結(jié)果。盡管采用雙鏈DNA模板的方法顯然既簡(jiǎn)單又方便（Chen和Seeburg，1985），然而只是在不久前得到改進(jìn)以后， 這一方法才發(fā)展到能夠獲得明確可信結(jié)果的水平。其中有兩個(gè)因素是至關(guān)重要的，這就是模板DNA的質(zhì)量和所用DNA聚合酶的種類(lèi)。小量制箅的質(zhì)粒DNA常常被寡脫氧核糖核苷酸小分子、核糖苷酸及DNA聚合酶的抑制劑所污染，其中前兩種污染物可被用作隨機(jī)引物。結(jié)果，種種“鬼"帶、強(qiáng)終止現(xiàn)象，以及其他假象往往使測(cè)序凝膠含混不清、黯然失色。因此采用小量制備的質(zhì)粒NDA來(lái)測(cè)定未知DNA克隆片段的序列，并不可取。然而,這類(lèi)DNA常可作為對(duì)已經(jīng)通過(guò)另一方法測(cè)定的序列進(jìn)行進(jìn)一步的合適模板。采用CsCl－溴化乙錠梯度平衡離心法來(lái)純化質(zhì)粒DNA，測(cè)序的結(jié)果會(huì)好得多，但卻要耗費(fèi)大量的人務(wù)和物力。模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)G或每一個(gè)T的位置上。