實(shí)驗(yàn)原理：質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb＝且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆,從原理上說(shuō)是很簡(jiǎn)單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。但在實(shí)際工作中, 如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無(wú)插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過(guò)調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來(lái)zui大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學(xué)手段如α互補(bǔ)現(xiàn)象等來(lái)鑒別重組子和非重組子。 
外源dna片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種： 
1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端,這也是zui容易克隆的DNA片段。 
2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 
3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 dna連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。 
特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無(wú)法相互匹配,則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli dna聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。 

一、 材料 PUC，ΛDNA 

二、 設(shè)備 恒溫?fù)u床， 臺(tái)式高速離心機(jī)， 
恒溫水浴鍋， ， 
電熱恒溫培養(yǎng)箱 ， 電泳儀無(wú)菌， 
超凈工作臺(tái)， 微量移液槍，Tip. eppendorf管。 

三、 試劑 10X bf T4 鏈接酶 
瓊脂糖 TAE 
Marker EB 
溴酚蘭 

四、 連接反應(yīng)