1 材料與方法
1.1 研究對(duì)象 從1995年3月至1996年3月在湖南省某縣以HBsAg為指標(biāo)篩檢前來終止妊娠的孕婦及其配偶。選擇8名男性HBV攜帶者與其子宮內(nèi)受染有胎兒為研究對(duì)象。攜帶者以elisa檢測(cè)常規(guī)五項(xiàng)HBV血清學(xué)標(biāo)志與PCR檢測(cè)HBV DNA確定。均無既往肝炎史，谷丙轉(zhuǎn)氨酶正常，無乙肝疫苗注射史，年齡在25～35歲之間。8名配偶以上述方法檢測(cè)均無HBV感染，年齡在23～33歲之間。夫婦雙方血清、白細(xì)胞、精液在住院期間收集。取終止妊娠3月以上胎兒。胎兒血在產(chǎn)出當(dāng)時(shí)采取并分離血清保存于－20℃，同時(shí)分離白細(xì)胞。無菌條件下取肝臟組織。胎兒血清、白細(xì)胞、肝臟任何一項(xiàng)HBV DNA陽(yáng)性者判定為子宮內(nèi)感染。另外選擇5對(duì)無HBV標(biāo)志的夫婦與胎兒為對(duì)照。
1.2 檢測(cè)方法
1.2.1 ELISA檢測(cè)HBV五項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志：HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc。
1.2.2 各種標(biāo)本的處理及DNA的抽提 抗凝血液標(biāo)本以白細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞并PBS反復(fù)洗滌以除去血液中HBV DNA的影響，恢復(fù)體積分小包裝低溫保存?zhèn)溆?；肝臟標(biāo)本取2g與PBS2ml在無菌研磨器中研磨成勻漿PBS反復(fù)洗滌后加PBS2ml后分小包裝低溫保存?zhèn)溆?；精液?biāo)本收集后離心將精子與精漿分開，精子以PBS反復(fù)洗滌以除去精漿中HBV DNA的影響，以PBS恢復(fù)體積分小包裝低溫保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鰳?biāo)本末次洗液PCR檢測(cè)HBV DNA均陰性，各種標(biāo)本按常規(guī)以、氯仿、異戊醇法提取DNA［3］。
1.2.3 PCR技術(shù)檢測(cè)HBV DNA 引物合成于中科院上海細(xì)胞所。S區(qū)與C區(qū)各設(shè)計(jì)一對(duì)套式PCR引物(表1)。*輪PCR產(chǎn)物1∶50稀釋作為第二輪PCR的模板，每輪PCR均設(shè)陽(yáng)、陰性對(duì)照與空白對(duì)照。常規(guī)PCR方法參考文獻(xiàn)［3］。
1.2.4 序列分析 取S區(qū)與C區(qū)第二輪PCR產(chǎn)物，以醋酸胺與異丙醇純化用Fmol DNA cycle sequencing system(promega公司)以雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序［3］。r-32P-ATP購(gòu)自北京亞輝公司。放射自顯影后讀片。結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)用DNASIS軟件處理并與發(fā)表的序列(genebank)比較。