1、高質(zhì)量RNA
成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的zui大值。一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測(cè)到擴(kuò)增結(jié)果（圖2）。另外，分離poly(A)+ RNA會(huì)導(dǎo)致樣品間mRNA豐度的波動(dòng)變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。但是我個(gè)人認(rèn)為不會(huì)，除非mRNA抽提試劑盒或者相關(guān)方法對(duì)內(nèi)參以及目的基因的mRNA有選擇性，否則樣本間抽提效率的差別*可以用內(nèi)參來(lái)校正啊。然而，當(dāng)分析稀有mRNA時(shí)，poly(A)+ RNA會(huì)增加檢測(cè)的靈敏度。

為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對(duì)于貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。

另外，長(zhǎng)度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對(duì)于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。

為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來(lái)源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10,000×g離心5分鐘。
也可以使用Qiagen等公司的特殊RNA保護(hù)試劑。Merck的inhibitor是世界*，大家可以選擇性使用。

在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長(zhǎng)度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在*鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因?yàn)閏DNA合成前的過程會(huì)使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白R(shí)Nase抑制劑僅防止RNase A，B，C對(duì)RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

2、使用無(wú)RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉(zhuǎn)錄酶
逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競(jìng)爭(zhēng)RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復(fù)合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長(zhǎng)度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會(huì)大有裨益。而且降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性會(huì)加大RT酶的熱穩(wěn)定性。通常有點(diǎn)突變和缺失突變兩種，優(yōu)先選擇缺失突變的。此外AMV酶熱穩(wěn)定性更高，。

3、提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度 

較高的溫度有助于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。
對(duì)于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物（三種引物都可以的）在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。這個(gè)方法可以試一試。但是這個(gè)步驟之后反應(yīng)條件如何設(shè)置我沒有經(jīng)驗(yàn)，是加入酶和其他反應(yīng)組分后變性再RT還是直接開始RT程序？我認(rèn)為后者才對(duì)。
此外是否可以考慮加入RNA inhibitor更為安全一些。
還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性（cDNA熱啟動(dòng)合成）。這種方法有助于防止較低溫度時(shí)所發(fā)生的分子間堿基配對(duì)。使用PCR儀可以簡(jiǎn)化RT-PCR所需的多種溫度切換。

然而某些模板仍然會(huì)存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。上面簡(jiǎn)單的處理方法倒是不花錢，呵呵。對(duì)這些困難模板的擴(kuò)增可以使用一些特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以置于較高溫度下進(jìn)行，增加特異性，尤其是當(dāng)使用基因特異性引物（GSP）進(jìn)行cDNA合成時(shí)。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預(yù)計(jì)的保溫溫度相同。 此外注意不要在高于60℃時(shí)使用oligo(dT)和隨機(jī)引物。隨機(jī)引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。此外 RNA在高于65℃時(shí)開始水解，對(duì)于≤1kb的RNA*鏈合成溫度可以為70℃，對(duì)于＞1kb的RNA則需要＜65℃。

4、促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑 

包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到*鏈合成反應(yīng)中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，zui多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受zui多20％的甘油而不降低活性。為了在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中zui大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加入到PCR中，那甘油在擴(kuò)增反應(yīng)中的濃度為0.4％，這不足以抑制PCR。

5、RNaseH處理 

在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對(duì)于某些模板，據(jù)認(rèn)為cDNA合成反應(yīng)中的RNA會(huì)阻止擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴(kuò)增較長(zhǎng)的全長(zhǎng)cDNA目標(biāo)模板時(shí)，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡRNaseH的處理加強(qiáng)了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號(hào)。對(duì)于多數(shù)RT-PCR反應(yīng)，RNaseH處理是可選的，因?yàn)?5℃保溫的PCR變性步驟一般會(huì)將RNA：DNA復(fù)合物中的RNA水解掉。