1．常規(guī)程序 
將 PCR 反應(yīng)所需的成分配置完后，在 PCR 儀上于 94-96℃ 預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘，使模板 DNA 充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于 94℃ 保持 30 秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復(fù)性溫度（一般 50-60℃ 之間），一般保持 30 秒鐘，使引物與模板充分退火；在 72℃ 保持 1 分鐘（擴(kuò)增 1kb 片段），使引物在模板上延伸，合成 DNA ，完成一個(gè)循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán) 25～35 次，使擴(kuò)增的 DNA 片段大量累積。zui后，在 72℃ 保持 3-7min ，使產(chǎn)物延伸完整， 4℃ 保存。 

2．復(fù)性（退火）和延伸溫度 
復(fù)性的溫度是 PCR 擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在 50-60℃ 之間。具體的溫度主要由引物的 Tm 值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為 72℃ 。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法 PCR 。 

3．反應(yīng)時(shí)間 
變性步驟一般使用 30 秒鐘，如果模板的 G+C 含量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。復(fù)性時(shí)間有 30 秒種一般是足夠的。延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定，一般采用 1kb 用 1 分鐘來(lái)保證充足的時(shí)間。 

4．循環(huán)次數(shù) 
循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，在模板拷貝數(shù)為 104～105 數(shù)量級(jí)時(shí)，循環(huán)數(shù)通常為 25～35 次。 
平臺(tái)效應(yīng)（plateau effect）：PCR 擴(kuò)增過(guò)程后期會(huì)出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低 ，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競(jìng)爭(zhēng)作用，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不*。 

5．PCR 反應(yīng)液的配制 
pcr反應(yīng)體系的配置方式有時(shí)也會(huì)影響反應(yīng)的正常進(jìn)行。常規(guī)方法與其它酶學(xué)反應(yīng)一樣，在zui后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 儀沒(méi)有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。 
對(duì)于使用具 3’-5’ 外切活性的高溫 DNA 聚合酶時(shí)，有時(shí)會(huì)擴(kuò)增不出產(chǎn)物。在遇到這個(gè)問(wèn)題時(shí)，如果將反應(yīng)成分分開(kāi)配制，A 管含模板、引物和 dNTP ，以及調(diào)整體積的 H2O ， B 管含緩沖液、DNA 聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來(lái)，可較好地克服這個(gè)問(wèn)題。 
按照常規(guī)的方法配制反應(yīng)體系，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題。熱啟動(dòng)（hot start）PCR操作方式可較好解決這一問(wèn)題。將 dNTP 、緩沖液， Mg2+和 primer 先配制好，然后加入一粒蠟珠（如 Ampli Wax PCR Qam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，zui后加入模板和 DNA 聚合酶等剩余成分。只有