一、限制與修飾（Restriction and modification）

1.限制與修飾現(xiàn)象

早在 50 年代初，有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)了限制與修飾現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)稱作寄主控制的專一性（host controlled specificity）。 l 噬菌體表現(xiàn)的現(xiàn)象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率可說明這一問題（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時(shí)會(huì)受到限制。

E.coli 菌株 λ噬菌體感染率 

lK lB lC 

E.coli K 1 10-4 10-4 

E.coli B 10-4 1 10-4 

E.coli C 1 1 1 

說明 K 和 B 菌株中存在一種限制系統(tǒng)，可排除外來的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果，此時(shí)限制系統(tǒng)還未起作用。而在 C 菌株不能限制來自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用實(shí)際就是限制酶降解外源 DNA ，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤 A 成為 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成為 5' 甲基胞嘧啶。通過甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。2.限制酶的發(fā)現(xiàn)

在 20 世紀(jì) 60 年代，人們就注意到 DNA 在感染宿主后會(huì)被降解的現(xiàn)象，從而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，從 E.coli K 中分離到限制酶，它有特定的識(shí)別位點(diǎn)但沒有特定的切割位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)離識(shí)別位點(diǎn)達(dá) 1000bp 以上。

1970 年，美國(guó)約翰·霍布金斯大學(xué)的 H. Smith 于偶然中發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌體 DNA ，其細(xì)胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，從而找到 HindⅡ 限制性內(nèi)切酶。 HindⅡ 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和切割位點(diǎn)如下：

5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '

3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '

從此以后，發(fā)現(xiàn)的限制酶越來越多，并且許多已經(jīng)在實(shí)踐中得到應(yīng)用。 EcoRⅠ 是應(yīng)用zui廣泛的限制性內(nèi)切酶，酶切位點(diǎn)和切割位點(diǎn)如下：

5' G↓AATTC 3'

3' CTTAA↑G 5'

限制性內(nèi)切酶的命名遵循一定的原則，主要依據(jù)來源來定，涉及宿主的種名、菌株號(hào)或生物型。命名時(shí)，依次取宿主屬名*字母，種名頭兩個(gè)字母，菌株號(hào)，然后再加上序號(hào)（羅馬字）。如 HindⅢ 限制性內(nèi)切酶， Hin 指來源于流感嗜血桿菌， d 表示來自菌株 Rd ， Ⅲ 表示序號(hào)。以前在限制性內(nèi)切酶和修飾酶前加 R 或 M ，且菌株號(hào)和序號(hào)小寫。但現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶名稱中的 R 省略不寫。

1986 年下半年發(fā)現(xiàn) 615 種限制酶和 98 種甲基化酶; 1998 年發(fā)現(xiàn) 10000 種細(xì)菌或古細(xì)菌中存在 3000 種酶，且酶有 200 多種特異性。到 2005 年 1 月，共發(fā)現(xiàn) 4342 種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 種，包括 Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 種，甲基化指導(dǎo)的限制酶有 3 種，商業(yè)化的限制酶有 588 種，在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 種特異性。

3.限制與修飾系統(tǒng)的種類

根據(jù)酶的亞單位組成、識(shí)別序列的種類和是否需要輔助因子，限制與修飾系統(tǒng)至少可分為四類。表 2-2 是各種限制與修飾系統(tǒng)的比較。

Ⅱ 型（type Ⅱ）限制與修飾系統(tǒng)所占的比例zui大，達(dá) 93% 。 Ⅱ 型酶相對(duì)來說zui簡(jiǎn)單，它們識(shí)別回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割 DNA ，產(chǎn)生帶 3'- 羥基和 5'- 磷酸基團(tuán)的 DNA 產(chǎn)物，需 Mg2+ 的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需 SAM 。識(shí)別序列主要為 4-6bp ，或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。

Ⅱs 型（type Ⅱs）限制與修飾系統(tǒng)，占 5% ，與 Ⅱ 型具有相似的輔因子要求，但識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱，也是非間斷的，長(zhǎng)度為 4-7bp ，切割位點(diǎn)可能在識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的 20bp 范圍內(nèi)。

Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚體（homodimer），由兩個(gè)彼此按相反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成，每個(gè)亞單位作用在 DNA 鏈的兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶來完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。

在 Ⅱ 型限制酶中還有一類特殊的類型，該酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，造成一個(gè)切口，這類限制酶也稱切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。

Ⅰ 型（type Ⅰ）限制與修飾系統(tǒng)的種類很少，只占 1% ，如 EcoK 和 EcoB 。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亞基和 M 亞基） 各作為一個(gè)亞基存在于酶分子中，另外還有負(fù)責(zé)識(shí)別 DNA 序列的 S 亞基，分別由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因編碼，屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位）。 EcoK 編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M2S 。 EcoB 編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M4S2 。

EcoB 酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的 A 為甲基化位點(diǎn)， N 表示任意堿基。

TGA*（N）8TGCT

EcoK 酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的 A 為可能的甲基化位點(diǎn)。

AA°C（N）6GTGC

但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn) 1000bp 以外，且無特異性。

Ⅲ 型（type Ⅲ）限制與修飾系統(tǒng)的種類更少，所占比例不到 1% ，如 EcoP1 和 EcoP15 。它們的識(shí)別位點(diǎn)分別是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位點(diǎn)則在下游 24-26bp 處。

在基因操作中，一般所說的限制酶或修飾酶，除非特指，均指 Ⅱ 型系統(tǒng)中的種類。

表2-2：各種限制與修飾系統(tǒng)的比較

 Ⅱ Ⅰ Ⅲ 

酶分子 內(nèi)切酶與甲基化酶

分子不在一起 三亞基雙功能酶 二亞基雙功能酶 

識(shí)別位點(diǎn) 4-6bp, 大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu) 二分非對(duì)稱 5-7bp 非對(duì)稱 

切割位點(diǎn) 在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)別位點(diǎn) 無特異性，至少在識(shí)別位點(diǎn)外 1000bp 在識(shí)別位點(diǎn)下游 24-26bp 

限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng) 分開的反應(yīng) 互斥 同時(shí)競(jìng)爭(zhēng) 

限制作用是否需用 ATP No Yes Yes 

二、限制酶識(shí)別的序列

1.限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度

限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度一般為 4-8 個(gè)堿基，zui常見的為 6 個(gè)堿基（表2-3）。當(dāng)識(shí)別序列為 4 個(gè)和 6 個(gè)堿基時(shí)，它們可識(shí)別的序列在*隨機(jī)的情況下，平均每 256 個(gè)和 4096 個(gè)堿基中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)（44=256，46=4096）。以下是幾個(gè)有代表性的種類，箭頭指切割位置。

4 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：Sau3AⅠ ↓GATC

5 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅡ ↓CCWGG

NciⅠ CC↓SGG

6 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅠ G↓AATTC

HindⅢ A↓AGCTT

7 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：BbvCⅠ CC↓TCAGC

PpuMⅠ RG↓GWCCY

8 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：NotⅠ GC↓GGCCGC

SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC

以上序列中部分字母代表的堿基如下。

R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C

K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T

H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G

D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T

2.限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)

限制酶識(shí)別的序列大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在 DNA 兩條鏈相對(duì)稱的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的識(shí)別序列和切割位置如下。

EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT

CTTAA↑G TTCGA↑A

有一些限制酶的識(shí)別序列不是對(duì)稱的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。識(shí)別序列后面括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示在兩條鏈上的切割位置。

AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG

GGC↑GAG GAGCA↑C

有一些限制酶可識(shí)別多種序列，如 AccⅠ 識(shí)別的序列是 GT↓MKAC ，也就是說可識(shí)別 4 種序列，其中兩種是對(duì)稱的，另兩種是非對(duì)稱的。 HindⅡ 識(shí)別的序列是 GTY↓RAC 。

有一些限制酶識(shí)別的序列呈間斷對(duì)稱，對(duì)稱序列之間含有若干個(gè)任意堿基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它們的識(shí)別序列如下。

AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG

GT↑CNNNGAC GANT↑C

3.限制酶切割的位置

限制酶對(duì) DNA 的切割位置大多數(shù)在內(nèi)部，但也有在外部的。在外部的，又有兩端、兩側(cè)和單側(cè)之別。切點(diǎn)在兩端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等;在兩側(cè)的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ（CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性與其它酶不同，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)的兩端各切開一個(gè)斷點(diǎn)，而不是只產(chǎn)生一個(gè)斷點(diǎn)。切點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)外側(cè)的還有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。

BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓

↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ ↑NNGTG（C）ACNN

三、限制酶產(chǎn)生的末端

1.限制酶產(chǎn)生匹配粘端（matched ends）

識(shí)別位點(diǎn)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），這樣形成的兩個(gè)末端是相同的，也是互補(bǔ)的。若在對(duì)稱軸 5' 側(cè)切割底物， DNA 雙鏈交錯(cuò)斷開產(chǎn)生 5' 突出粘性末端，如 EcoRⅠ ;若在 3'-側(cè)切割，則產(chǎn)生 3' 突出粘性末端，如 KpnⅠ 。

NNG↓AATTCNN EcoRⅠ NNG AATTCNN

NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN

2.限制酶產(chǎn)生平末端（Blunt end）

在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割 DNA 的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端，如 HaeⅢ（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）。產(chǎn)生平末端的 DNA 可任意連接，但連接效率較粘性末端低。

3.限制酶產(chǎn)生非對(duì)稱突出端

許多限制酶切割 DNA 產(chǎn)生非對(duì)稱突出端。當(dāng)識(shí)別序列為非對(duì)稱序列時(shí)，切割的 DNA 產(chǎn)物的末端是不同的，如 BbvCⅠ ，它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下。

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG

有些限制酶識(shí)別簡(jiǎn)并序列，其識(shí)別的序列中有幾種是非對(duì)稱的。如 AccⅠ ，它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 為非對(duì)稱。

GT↓AT/CGAC

CATA/GC↑TG

有些限制酶識(shí)別間隔序列，間隔區(qū)域的序列是任意的，如 DraⅢ 和 EarⅠ

4.同裂酶（isoschizomer）

識(shí)別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)可能不同。具體可分為以下幾種情況。

① 同序同切酶 這些酶識(shí)別序列和切割位置都相同，如 HindⅡ 與 HincⅡ 識(shí)別切割位點(diǎn)為 GTY↓RAC ， HpaⅡ 與 HapⅡ 識(shí)別切割位點(diǎn)為 C↓CGG ， MobⅠ 與 Sau3AⅠ 識(shí)別切割位點(diǎn)為 ↓GATC 。

② 同序異切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 識(shí)別的序列是相同的，但它們的切割位點(diǎn)不同，分別為 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。另外， Asp718Ⅰ 識(shí)別和切割位點(diǎn)為 G↓GTACC 。

③“同功多位”許多識(shí)別簡(jiǎn)并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如 EcoRⅠ 識(shí)別和切割位點(diǎn)為 G↓AATTC ， ApoⅠ 識(shí)別和切割位點(diǎn)為 R↓AATTY ，后者可識(shí)別前者的序列。另外， HpaⅠ 和 HincⅡ 的識(shí)別位點(diǎn)也有交叉，它們的識(shí)別和切割位點(diǎn)分別為 GTT↓AAC 和 HincⅡ 。

④ 其它有些限制酶識(shí)別的序列有交叉，如在 pUC 系列質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中有一個(gè) SalⅠ 位點(diǎn)（識(shí)別切割位點(diǎn)為 G↓TCGAC），該位點(diǎn)也可被 AccⅠ（識(shí)別切割位點(diǎn)為 GT↓MKAC）和 HincⅡ（識(shí)別切割位點(diǎn)為 GTY↓RAC）切割。

5.同尾酶

許多不同的限制酶切割 DNA 產(chǎn)生的末端是相同的，且是對(duì)稱的，即它們可產(chǎn)生相同的粘性突出末端。這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。這些酶切割 DNA 得到的產(chǎn)物可進(jìn)行粘端連接。以下幾種酶產(chǎn)生的末端是相同的。通過表 4-3 很容易判斷哪些酶可產(chǎn)生相同的 DNA 末端。

·EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY

·SpeⅠ A↓CTAGT NheⅠ G↓CTAGC XbaⅠ T↓CTAGA

·BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC StyⅠ C↓CWWGG

·ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （pUC19）

6.識(shí)別特殊系列的 I-prefix 和 pI-prefix 系列酶

有些線粒體、葉綠體、核 DNA 、T 偶數(shù)噬菌體含有一些編碼內(nèi)切酶的內(nèi)含子，有些 intein （protein splicing element） 也有內(nèi)切酶的活性，這兩類內(nèi)切核酸酶稱為 I-prefix 和 pI-prefix 系列內(nèi)切酶，它們識(shí)別的序列很長(zhǎng)。 I-prefix 是由在 RNA 水平上剪切和編碼的， pI-prefix 在蛋白質(zhì)水平上剪切的產(chǎn)物。這類內(nèi)切酶也稱為 homing endonuclease ，目前商業(yè)化的種類有 6 種。從因特網(wǎng)上可以找到 Intein 的數(shù)據(jù)庫 Inbase（Intein Database），該由 New England BioLabs 公司維護(hù)（http://www.neb.com）。

I-CeuI 酶是衣滴蟲（Chlamydomonas eugametos）葉綠體大 rRNA 基因的內(nèi)含子編碼的產(chǎn)物，識(shí)別位點(diǎn)為 26bp ，識(shí)別的核心部位為 -12 至 +7 位置的 19bp 。反應(yīng)溫度為 37℃ ，識(shí)別位點(diǎn)如下，方框內(nèi)為核心識(shí)別序列。

TAACTATAACGGTC↑CTAA↓GGCA

四、DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響

限制酶切割 DNA 時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求，也就是說在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。

用 20 單位（Units）限制酶切割 1mg 標(biāo)記的寡核苷酸做測(cè)試時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的酶對(duì)識(shí)別序列兩端的長(zhǎng)度有不同的要求（表 2-4）。相對(duì)來說， EcoRⅠ 對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較小，在識(shí)別序列外側(cè)有一個(gè)堿基對(duì)時(shí)在 2 小時(shí)的切割活性可達(dá) 90% 。而 AccⅠ 和 HindⅢ 對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較大。

表2-4：靠近DNA，片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測(cè)） 

限制酶 待測(cè)的寡核苷酸序列 待測(cè)的寡核苷酸序列 

2hr 20hr 

AccⅠ CCGGTCGACCGG 0 0 

HindⅢ CAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG 0

0

10 0

0

75 

EcoRⅠ GGAATTCC >90 >90 

PstⅠ GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）20 0

10

>90

0 0

10

>90

0 

用 DNA 片段（線性載體）檢測(cè)末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)識(shí)別序列的末端長(zhǎng)度對(duì)酶切效率有明顯影響，不同的酶對(duì)末端長(zhǎng)度的要求是不同。

在設(shè)計(jì) PCR 引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順利切割擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。另外，了解末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點(diǎn)時(shí)選擇酶切秩序。

五、位點(diǎn)偏愛（Site preference）

某些限制酶對(duì)同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛性切割，即對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛。

某些噬菌體 DNA 中的某些相同的酶切位點(diǎn)對(duì)酶的敏感性是不同。λ 噬菌體 DNA 為 48502bp ，含 12bp 粘端。 EcoRⅠ 酶切割 l 噬菌體中的 5 個(gè)位點(diǎn)時(shí)并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快 10 倍; EcoRⅠ 對(duì)腺病毒 2（adenvirus-2）DNA 不同位置切點(diǎn)的切割速率也不同。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 在 l 噬菌體 DNA 中的切割速率分別有 10 倍和 14 倍的差異。 l 噬菌體 DNA 有 4 個(gè) SacⅡ 位點(diǎn)，三個(gè)在，一個(gè)在右臂，對(duì)三個(gè)位點(diǎn)的酶切速度快 50 倍。在 φX174 噬菌體 （單鏈環(huán)狀， 5386bp ， DNA 復(fù)制時(shí)可以雙鏈形式存在） DNA 中發(fā)現(xiàn) HgaⅠ 切割某些位點(diǎn)比其它的快。在腺病毒 2 中， CTCGAG 位點(diǎn)對(duì) PaeR7Ⅰ *抵抗，但同裂酶 XhoⅠ 卻很易切割，原因是 5' 末端有一個(gè) CT 二核苷酸，與甲基化*無關(guān)。

造成上述現(xiàn)象的原因有以下幾種情況。 NarⅠ ， NaeⅠ 和 SacⅡ 三種酶屬于在切割 DNA 之前需要同時(shí)與兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)作用的一類酶。 BspMⅠ、EcoRⅡ 和 HpaⅡ 則屬另一種情況，它們對(duì)要求作用的 DNA 序列上有兩個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)是為 DNA 切割激活另一個(gè)的變構(gòu)位點(diǎn)（allosteric）。這兩序列可由順式（cis）方式提供，即相互靠近或形成環(huán)（loop）;或由反式（trans）方式提供，其變構(gòu)位點(diǎn)由含識(shí)別序列的寡核苷酸提供。

六、酶切反應(yīng)條件

1.緩沖液

常規(guī)緩沖液一般包括提供穩(wěn)定 pH 值的緩沖劑、 Mg++ 、 DTT（二硫蘇糖醇）以及 BSA（小牛血請(qǐng)白蛋白）。

pH 經(jīng)常為 7.0-7.9（在 25℃ 時(shí)），用 Tris-HCl 或乙酸調(diào)節(jié); Mg++ 作為酶的活性中心，由 MgCl2 和 MgAc 提供; 濃度常為 10mM ;DTT 濃度常為 1mM 。有時(shí)緩沖液中還要加入 100mg/ml BSA ，但只是少數(shù)反應(yīng)需要。不同的酶對(duì)離子強(qiáng)度的要求差異很大，并依次將限制酶緩沖液按離子強(qiáng)度的差異分為高、中、低三種類型，離子強(qiáng)度以 NaCl 來滿足，濃度分別為 100mM 、50mM 和 0mM 。

要對(duì) DNA 進(jìn)行雙酶切時(shí)，如何選擇緩沖液是相當(dāng)重要的。一方面可選用都合適的緩沖液或通用緩沖液;若找不到共用的緩沖液則先用低濃度的，再加適量 NaCl 和第二種酶;或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液（DNA 可純化或不純化）。

2.反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度大多數(shù)為 37℃ ，一部分為 50-65℃ ，少數(shù) 25-30℃ 。高溫作用酶在 37℃ 下的活性會(huì)下降，多數(shù)僅為zui適條件下的 10-50% 。如 Taq 限制酶（正常反應(yīng)溫度為 65℃），在 37℃ 只有在 65℃ 活性的 10% ; ApoⅠ（正常反應(yīng)溫度為 50℃）， 37℃ 只有在 50℃ 時(shí)活性的 50% 。銷售商在產(chǎn)品說明中都會(huì)標(biāo)明*反應(yīng)溫度。

3.反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)時(shí)間通常為 1 小時(shí)或更多，許多酶延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可減少酶的用量。 EcoRⅠ 若反應(yīng) 16 小時(shí)，所需酶量為正常酶切時(shí)間的 1/8 ，即若反應(yīng)時(shí)間為 16 小時(shí)，則所用酶量為只切 1 小時(shí)的 1/8 。其它一些酶也有類似情況，如HindⅢ為1/8;KpnⅠ為1/4;BamHⅠ為1/2。

4.終止酶切的方法

EDTA 可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應(yīng)，終止?jié)舛葹?/span> 10mM ;加熱是常用的方法，對(duì)于*反應(yīng)溫度為 37℃ 的酶，在 65℃ 或 80℃ 處理 20 分鐘可使酶活性大部分喪失。但是對(duì)于在 80℃ 作用 20 分鐘也有不失活的酶，如*反應(yīng)溫度為 37℃ 的酶 Bg1Ⅱ、HpaⅠ 和 PvuⅡ ， 65℃ 酶 Tth111Ⅰ 和 TspRⅠ ，以及 50℃ 酶 Bc1Ⅰ ，可用抽提去除蛋白，或用試劑盒純化 DNA 。

七、星星活性（star activity）

在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性。實(shí)際上星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)，如 ApoⅠ、AseⅠ、BamHⅠ、BssH11、EcoRⅠ、EcoRV、HindⅢ、HinfⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、ScaⅠ、TaqⅠ 和 XmnⅠ 等酶皆可表現(xiàn)出星星活性。星星活性在絕大多數(shù)情況下是可控制的。

限制酶的特異性變化方式與酶的種類和所用的條件有關(guān)，zui普遍的活性變化來自 1 個(gè)堿基的變化、識(shí)別位點(diǎn)外層堿基的隨意性，以及單鏈缺口。

引起星星活性的因素有油濃度高（>5%），酶過量（>100U/ml），離子強(qiáng)度低（<25mM）， pH 值過高（>8.0），或是加了有機(jī)溶劑如 PMSD （二甲基亞砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、 sulphalane 等等，或是用其它二價(jià)陽離子如 Mn++ 、Cu++、Co++ 或 Zn++ 代替了 Mg++ 。但不同的酶對(duì)上述條件的敏感性不一樣，如 PstⅠ 比 EcoRⅠ 對(duì)高 pH 更敏感，但后者對(duì)油濃度更敏感。

抑制星星活性的措施有許多，如減少酶的用量（可避免過份酶切），減少油濃度，保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶劑或乙醇，提高離子強(qiáng)度到 100～150mM （如果不會(huì)抑制酶的活性的話），降低反應(yīng) pH 至 pH7.0 ，以及保證使用 Mg++ 作為二價(jià)陽離子。

八、單鏈 DNA 的切割

部分切割雙鏈 DNA 的酶也可消化其單鏈，但是切割效率不同。 HinPⅡ、HhaⅠ、MnlⅠ 切割單鏈 DNA 的效率是切割雙鏈的 50% ， HaeⅢ 切割單鏈 DNA 的效率是切割雙鏈的 10% ， BstNⅠ、DdeⅠ、HgaⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ 切割單鏈 DNA 的速度比切割雙鏈慢 100 倍。還有一些酶不切割單鏈 DNA ，如 AluⅠ、BbvⅠ、DpnⅠ、FnuDⅡ、FokⅠ、HpaⅡ、HphⅠ、MobⅠ、MobⅡ、MspⅠ、Sau3AⅠ、SfaNⅠ 等等。

有些限制酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，產(chǎn)生單鏈缺口，即切口酶（nicking enzyme），如 N.BstNBⅠ。這類酶在命名時(shí)前面要加一個(gè) N 。目前已經(jīng)商品化的這類酶共有 7 種。 N.BstNBⅠ 的識(shí)別序列和切割位置如下。

5′... G A G T C N N N N N ...3′

3′... C T C A G N N N N N ...5′

九、酶切位點(diǎn)的引入

在酶切水平上，通過酶切和連接可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。

（1）將產(chǎn)生的 5' 突出端補(bǔ)平后，再連接可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。 EcoRⅠ 的識(shí)別位點(diǎn)是 GAATTC ，先用它來切片段，將 5' 突出端補(bǔ)平后，再連接可產(chǎn)生 XmaⅠ（GAANNNNTTC）和 AceⅠ（ATTAAT）酶切位點(diǎn)，而 EcoRⅠ 的酶切位點(diǎn)消失。

……G AATTC…… 補(bǔ)平 ….GAATT AATTC…. 連接 ….GAATTAATTC…

……CTTAA G…… ….CTTAA TTAAG…. ….CTTAATTAAG…

對(duì) HindⅢ 位點(diǎn)（AAGCTT）來說，經(jīng)酶切和連接可產(chǎn)生 AluⅠ 和 NheⅠ 酶切位點(diǎn)，同時(shí) HindⅢ 位點(diǎn)消失。

（2）同尾末端的連接。不同的同尾酶切割 DNA 產(chǎn)生的末端再相互連接時(shí)，可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，同時(shí)原來的酶切位點(diǎn)卻消失。例如 BamHⅠ（G↓AATCC）+ BclⅠ（T↓GATCA）→ AlwⅠ（GGATC 4/5），又如 XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或 NheⅠ 或 SpeⅠ 或 StyⅠ（CCTAGG）→ BfaⅠ（C↓TAG） 也產(chǎn)生了新的酶切位點(diǎn)。

（3）平端連接。平末端的限制酶切割的DNA在連接后也可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，例如 PvuⅡ（CAGCTG）+ EcoRV（GATATC）→ MobⅠ（GATC）。

十、影響酶活性的因素

影響酶切活性的因素有許多，概略的說可分為外因和內(nèi)因。外因是可預(yù)見和控制的，如反應(yīng)條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時(shí)加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積的選擇以及反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短等等。內(nèi)因包括位點(diǎn)偏愛性、甲基化底物、底物的構(gòu)象。構(gòu)象的影響主要指切割線性 DNA 和超螺旋 DNA 時(shí)的活性，如與切割 lDNA 相比， EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ 需要至少 2.5-10 倍的酶來切割 pBR322 的超螺旋 DNA 。 PaeRTⅠ 與 XhoⅠ 切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果 5' 端為 CT 則 PaeRTⅠ 不能切割。

十一、酶切位點(diǎn)在基因組中分布的不均一性

在基因組中堿基對(duì)的排列是非均勻的，因此盡管有的酶切序列中 GC 含量相同，但在基因組中出現(xiàn)的機(jī)率還是不一樣。如在 E.coli 中， AsoⅠ（GGCGCGCC）切點(diǎn)平均 20kb 中出現(xiàn)一個(gè)，而 NotⅠ（GCGGCCGC） 切點(diǎn)平均 200kb 中出現(xiàn)一個(gè)（常利用它出現(xiàn)的機(jī)會(huì)少來構(gòu)建圖譜）， EcoRⅠ 和 HindⅢ 切點(diǎn)平均 5kb 中出現(xiàn)一個(gè)，而 SpeⅠ（ACTAGT） 切點(diǎn)平均 60kb 中出現(xiàn)一個(gè)。