SOD的催化使超氧自由基(O2-)被破壞，并針對(duì)氧毒性筑起了*道防線。SOD的活性及其檢測(cè)技術(shù)與許多不同領(lǐng)域都息息相關(guān)，如醫(yī)藥、生化、植物生理、食品工程等。在過(guò)去的幾十年中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了各種各樣的SOD檢測(cè)方法，但是，這些方法在選擇性、檢測(cè)速度、價(jià)格、簡(jiǎn)便程度上都存在各自的缺陷。zui近，我們發(fā)現(xiàn)水溶性四唑鹽如XTT，WST-1，WST-8適合用于O2-的檢測(cè)并且也可以被用于SOD的檢測(cè)。在這些四唑鹽中，WST-1靈敏度高，氧化態(tài)的吸光度低，水溶性好，因此，用來(lái)做SOD檢測(cè)。這種用WST-1來(lái)檢測(cè)SOD的方法可以被用于鼠紅血球、心臟、肝臟等生化樣品中。我們還發(fā)現(xiàn)了一種使用了WST-1的流式注射法檢測(cè)SOD的檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)這個(gè)系統(tǒng)能夠進(jìn)行快速的檢測(cè)（每小時(shí)可以檢測(cè)30個(gè)樣品）。
常用的幾種SOD檢測(cè)方法：
1.分光光度法
分光光度法是zui為典型的檢測(cè)SOD的方法，這種方法使用了細(xì)胞色素 C(cytochrome C)或者氮藍(lán)四唑（NBT）（圖1）。用cytochrome C的還原法來(lái)檢測(cè)O2-是因?yàn)檫€原后的cytochrome C會(huì)生成紫色的染料（圖解 2）。這是自SOD被發(fā)現(xiàn)以來(lái)zui常用的方法
Cyt(FeⅢ) + O2- —> Cyt(FeⅡ) + O2
因?yàn)閏ytochrome C很容易被NADPH還原酶或者其他的還原劑所還原，因此必須要考慮樣品的污染因素。而且，這種方法需要每隔1.5分鐘就要察看一下，因此不適合做大批量的實(shí)驗(yàn)。NBT法的原理是生成不溶于水的藍(lán)色甲臢染料(max: 560 nm)去和O2-反應(yīng)。這種染料不溶于水，在做長(zhǎng)時(shí)程分析時(shí)會(huì)生成不均一的沉淀物，從而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。為了得到水溶性的甲臢染料，許多改良后的方法如添加BSA被人們所采用。但是，添加了不必要的蛋白質(zhì)會(huì)使數(shù)據(jù)分析變得十分復(fù)雜，而且NBT會(huì)被多種還原劑所還原。NBT的這種特性被用于酮胺的檢測(cè)，酮胺可以作為糖尿病的標(biāo)記物并且是Maillard反應(yīng)的中間體。NBT法的zui大缺點(diǎn)是即使加入過(guò)量的SOD也不能獲得的抑制率，原因是NBT會(huì)與黃嘌呤氧化酶直接反應(yīng)。
1． 化學(xué)發(fā)光法
用于O2-檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光探針同樣也能用于SOD的檢測(cè)，這種探針?lè)譃?種，一種是光澤精，另一種是熒光素衍生物（MCLA）。這種化學(xué)發(fā)光反應(yīng)對(duì)pH有高度的依賴性。例如，光澤精只有在pH 9.0或者更高處會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的化學(xué)光。因此，在生理的pH條件下用這種方法檢測(cè)SOD是不可行的。另一方面，MCLA在生理?xiàng)l件下能夠發(fā)出較強(qiáng)的化學(xué)熒光，因此可以用于人腦的Cu,Zn-SOD活性的檢測(cè)。但是，MCLA不適合用作SOD檢測(cè)的探針，因?yàn)樗粏螁魏蚈2-反應(yīng)，還會(huì)和單質(zhì)氧反應(yīng)。而且MCLA與溶解氧反應(yīng)后會(huì)發(fā)出化學(xué)光，轉(zhuǎn)移的金屬離子還會(huì)加速氧化反應(yīng)。
3.電子自旋共振（ESR）光譜法
在室溫下，溶液中O2-的ESR信號(hào)不能直接被檢測(cè)出，但能夠通過(guò)自旋捕捉法間接獲得。zui常見(jiàn)的誘捕劑是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)。由于O2- 誘捕DMPO會(huì)產(chǎn)生一個(gè)特殊的光譜圖，因此ESR法是O2-檢測(cè)的方法中特異性的一種。然而，DMPO與O2-間的二階速度常數(shù)比O2-自發(fā)反應(yīng)常數(shù)相對(duì)要低，因此需要向溶液中加入大量的DMPO（如：終濃度為0.45M）。這樣，每次試驗(yàn)所要用的DMPO將花去大筆的經(jīng)費(fèi)。
這種方法的另一個(gè)問(wèn)題是在實(shí)驗(yàn)中需要一套較為昂貴的ESR設(shè)備。
4．利用水溶性四唑鹽檢測(cè)SOD的新方法
為了克服上述的諸多問(wèn)題，我們?cè)谧鯯OD檢測(cè)時(shí)需要考慮如下幾個(gè)方面：實(shí)驗(yàn)設(shè)備要簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，pH靈敏度要低，對(duì)O2-有高度的特異性。如果用分光光度計(jì)作為一種簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的話，就需要一種與cytochrome C和NBT相似的比色探針。檢測(cè)中zui重要的一點(diǎn)是在沒(méi)有其他物質(zhì)干擾的情況下，測(cè)定出SOD的抑制率。為了得到一種新的檢測(cè)SOD的方法，我們對(duì)還原后能生成水溶性甲臢的四唑鹽作了一系列的實(shí)驗(yàn)。
4．1 XTT
XTT是一種在1988年被報(bào)道的水溶性四唑鹽，自從那時(shí)起，它就被用作細(xì)菌或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的底物。它的結(jié)構(gòu)如圖1所示。NBT具有一個(gè)雙四唑鹽結(jié)構(gòu)，而XTT的結(jié)構(gòu)則為單四唑鹽并且有兩個(gè)璜酸基團(tuán)。
超氧化物歧化酶(SOD)的檢測(cè)方法
圖1. SOD檢測(cè)中的四唑鹽的結(jié)構(gòu)
我們用XTT來(lái)檢測(cè)SOD，如圖2所示，隨著SOD濃度的上升，可以觀察到的抑制率。這種的抑制率在過(guò)去用NBT法時(shí)從沒(méi)得到過(guò)。即使在不同的pH條件下，仍能觀察到的抑制率。XTT的這種的抑制率意味著XTT只會(huì)被O2-特異地還原，XTT解決了NBT所不能解決的問(wèn)題。
超氧化物歧化酶(SOD)的檢測(cè)方法
圖2. 用NBT（●）和XTT（○）所得的SOD的抑制曲線
