1、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、燒瓶、試管等。

2、分離組織需要的眼科剪子、子。

3、5%CO2孵箱、PH計(jì)、95%氧氣源。

4、36電動(dòng)恒溫水浴。

5、培養(yǎng)液、各種緩沖液及添加劑DMEM高糖培養(yǎng)基、Hank’s緩沖液 、20%胎牛血清，轉(zhuǎn)換生長因子（TGF-β1）(5ng/mL)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（10ug/mL胰島素，5ug/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，和0.5ng/mL亞硒酸鹽）100U/Ml，100U/ml 。

6、消化液 膠原酶(collagenase) 200U/ml 0.4%臺(tái)盼蘭、0.25

Method 1 組織塊法

1、取材：空氣栓塞法處死家兔后，在無菌狀態(tài)下獲取家兔椎間盤組織。置于準(zhǔn)備好的DMEM培養(yǎng)基（含雙抗）。迅速帶回到無菌超凈臺(tái)上。（注意事項(xiàng)：椎間盤位于相鄰兩個(gè)椎體之間，取材過程較為繁瑣，要求動(dòng)作迅速，爭取在家兔死后半小時(shí)內(nèi)完成，否則，該組織對(duì)缺氧耐受性差導(dǎo)致培養(yǎng)失敗）。

2、剪切：在超凈臺(tái)上，進(jìn)一步將周圍組織分離，用Hank’s液沖洗數(shù)遍，直到?jīng)_洗液透明為止。眼科剪刀將組織修剪為1~2cm3大小的小組織塊，Hank’s沖洗干凈。 加入少量含血清的培養(yǎng)液。(組織塊不宜過小，否則不容易爬出足夠數(shù)量的細(xì)胞)

3、接種：用吸管吸取小組織塊入培養(yǎng)瓶底部，擺放均勻，一個(gè)25cm2的培養(yǎng)瓶可放置10-15個(gè)小組織塊，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入少量培養(yǎng)液。4~6小時(shí)后，待組織塊充分貼壁后，再翻轉(zhuǎn)回來（動(dòng)作一定要輕巧，以免剛剛貼壁的組織塊脫離瓶底）

4、置于5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔3天換液。待細(xì)胞95%融合時(shí)，0.25傳代分瓶。

Method 2 消化法

前面步驟同組織塊法1，2。

（3）組織塊再進(jìn)一步剪切，此時(shí)培養(yǎng)液中不加血清。完畢后，加入消化液，移入到10ml 離心管，培養(yǎng)箱內(nèi)消化。每隔20分鐘，用吸管吹打一次，觀察液體有否變渾濁，并取少量液體，在相差倒置顯微鏡下觀察。0.4%臺(tái)盼蘭染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目。接種密度在105數(shù)量級(jí)。置于5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔3天換液。待細(xì)胞95%融合時(shí)，0.25傳代分瓶

Result: IVD細(xì)胞為類軟骨細(xì)胞，描述：單層細(xì)胞形狀不規(guī)則，可呈三角形、多角形，梭形及不規(guī)則形。不同于成纖維細(xì)胞