用骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色體標(biāo)本的制備,不需要體外培養(yǎng),因此,不需無菌操作,整個(gè)過程所需時(shí)間短,方法比較簡(jiǎn)單,一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。
一、制作方法
1、取樣
將25g體重的蟾蜍用頸椎脫臼法殺死。殺死前2~3h,腹腔注射0.1%濃度的秋水仙素溶液(注射量以4μg/g體重計(jì)算)。殺死后,取每側(cè)的股骨和肱骨各一根,去凈外面的肌肉組織,剪去兩頭,用注射針頭吸入一些生理鹽水,將骨髓沖至一小培養(yǎng)皿中,反復(fù)幾次,將全部沖出物吸入離心管內(nèi)離心(1000轉(zhuǎn)/min)8min。
2、低滲處理
吸去上清液,加入在37℃中預(yù)熱的0.4%KCl溶液至5ml,用吸管輕輕吸動(dòng),使細(xì)胞松散,在37℃溫度,低滲20min,離心8min(100轉(zhuǎn)/min),在離心前加入1ml固定液作預(yù)處固定,防止細(xì)胞松散。
3、固定
吸去上清液,沾管壁加入甲醇∶冰醋酸=3∶1的的固定液5ml,固定5min后,用吸管將沉淀物輕輕打勻,再繼續(xù)固定30min離心8min(100轉(zhuǎn)/min)。 吸去上清液,再加固定液固定一次,用吸管打散靜止15~20min,離心8min(1000轉(zhuǎn)/min)吸去上清液,留沉淀物,再加少量固定液混勻,即可制片。
4、 制片及染色
從冰箱中取出預(yù)冷玻片,平置在手中,然后,將標(biāo)本混勻液從一定的高處滴下,并立即用口吹散,在酒精燈上加熱干燥。干燥后,將稀釋10倍的Giemsa染液(用前稀釋)滴于玻片上,染色20~30min,流水沖洗幾秒鐘,在酒精燈上干燥后,即可置于顯微鏡下觀察。
二、觀察
在高倍顯微鏡下觀察蟾蜍骨髓淋巴細(xì)胞的染色體。我們可能看到有11對(duì)(2n=2×11=22)等臂的染色單體,每一條都呈V字形?;拘螒B(tài)如下圖。在顯微鏡下,染成紅色的為染色體和著絲粒,染成淺藍(lán)色的為細(xì)胞質(zhì),染色單體沒有著絲縊痕和次縊痕。
三、Giemsa 染液的配制:
1、Giemsa原液的配制(1ml)
Giemsa粉劑0.5g、甘油(A·R)33ml、甲醇(不含丙酮)(A·R)33ml。 將少量甘油中加入粉劑,用研缽磨至無顆粒為止,再加入全部甘油33ml,放56℃溫箱中2h溶化后加甲醇33ml,搖勻后保存于棕色瓶中,用時(shí)稀釋10倍。
2、磷酸緩沖液(pH=7)的配制
取1/15M磷酸二氫鉀溶液38.8ml和1/15M溶液61.2ml混合后,即可得pH=7的磷酸緩沖液