實(shí)驗(yàn)?zāi)康?nbsp;
1. 學(xué)會(huì)DNA限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)。
2. 瓊脂糖凝膠電泳法觀察酶切DNA的結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)原理
質(zhì)粒pUC118上有限制性內(nèi)切酶BamHI的識別序列G↓GATCC,用BamHI酶切后形成線性質(zhì)粒dna。瓊脂糖凝膠電泳可以按酶切產(chǎn)物分子量的大小分離DNA片段,小片段比大片段遷移快,凝膠上遷移的距離與分子量的對數(shù)成反比。要準(zhǔn)確地確定DNA片段的大小,必須用分子量標(biāo)準(zhǔn)物同時(shí)進(jìn)行電泳對照。常用的分子量標(biāo)準(zhǔn)是lDNA/EcoRI、lDNA/HindIII、lDNA/EcoRI+HindIII的酶切片段
DNA的限制性內(nèi)切酶酶切
DNA的限制性內(nèi)切酶酶切
實(shí)驗(yàn)材料和試劑
(一)實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)二提取的質(zhì)粒pUC118???
(二)試劑
1.限制性內(nèi)切酶BamHI
2.l DNA/HindIII分子量標(biāo)準(zhǔn)
3.雙蒸餾無菌水
4.溴酚藍(lán)指示劑點(diǎn)樣緩沖液
5.1mg/ml溴化乙錠溶液
6.電泳緩沖液(TAE)
7.0.7% 瓊脂糖凝膠(用TAE電泳緩沖液配制)
(三)器材
1.5ml Eppendorf管 200ml吸頭
(四)儀器
微量移液器 離心機(jī)
恒溫水浴鍋 電泳儀
水平電泳槽 透射紫外觀察儀
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 取一個(gè)滅菌的Eppendorf管,依次加入下列試劑:
雙蒸餾無菌水 12ml
10×BamHI緩沖液 2ml
質(zhì)粒pUC118 5ml
BamHI 1ml
總體積 20ml
2. 用手指輕彈管壁,使各種試劑混勻,快速離心,以集中溶液。
3. 置37℃水浴60~120 分鐘。
4. 加入5ml溴酚藍(lán)指示劑點(diǎn)樣緩沖液,按實(shí)驗(yàn)三方法電泳,觀察酶切反應(yīng)結(jié)果,鑒定酶切效果。
【提示】
實(shí)驗(yàn)操作中注意的問題
1. 酶切反應(yīng)用的Eppendorf管和吸頭,都要用新的,用雙蒸餾水洗凈,滅菌。使用前打開包裝,用鑷子夾取,不要直接用手去拿,以防手上的雜酶污染。
2.DNA樣品和限制性內(nèi)切酶的用量都極少,必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性及全部放入反應(yīng)體系中。
3.要注意酶切加樣的次序,一般次序?yàn)殡p蒸餾無菌水、緩沖液、DNA各項(xiàng)試劑,zui后才加酶。
4.取酶時(shí),吸頭要從酶液的表面吸取,以防止吸頭沾上過多的酶液。待用的酶要放在冰浴內(nèi),用后蓋緊蓋子,立即放回-20℃冰箱中,防止酶失活。
5.當(dāng)樣品在37℃保溫時(shí),要將Eppendorf管的蓋子蓋緊,防止因蓋子未蓋嚴(yán)密使水進(jìn)入管內(nèi),造成實(shí)驗(yàn)失敗。