方法簡介
所謂的實時熒光定量 PCR 就是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著 PCR 反應的進行，PCR 反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。
RT-QPCR是由三個步驟組成:
1.反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA;
2.擴增:用PCR的方法擴增cDNA;
3.檢測:實時檢測和定量擴增的產物.
RT-qRCR影響分析可靠性關鍵點(Key porint):
1.分析結果依賴于模板的數(shù)量、質量以及合理的檢測方法設計
2.反轉錄反應的非標準化影響試驗的穩(wěn)定性
3.數(shù)據(jù)分析應該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結果中會得到混淆的錯誤結果，因此通過對RT-qPCR的每一組分進行質量評價以達到zui小化變異性，zui大化可重復性，而且還需要沿用一個通用的數(shù)據(jù)分析的指南。對基因表達分析的標準化的需要是與人類臨床診斷分析相適應的。
實時定量PCR*手冊
實時定量PCR*手冊
