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3-磷酸甘油酸激酶試劑盒說明書

2017年09月20日 10:17:31人氣:495來源:齊一生物科技(上海)有限公司

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關(guān) 鍵 詞3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase,PGK) 試劑盒說明書
【資料簡介】

3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase,PGK) 試劑盒說明書 
分光光度法 50管/48樣 
注意:正式測定之前選擇 2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。 
3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase,PGK) 試劑盒說明書 測定意義 
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶,廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi),催化 1,3-二磷酸
甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)?3-磷酸甘油酸,產(chǎn)生1分子 ATP,具有影響 DNA復(fù)制和修補(bǔ)及刺激病毒RNA
合成等生物學(xué)功能,廣泛應(yīng)用于藥物靶標(biāo)設(shè)計。 
測定原理 
3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP產(chǎn)生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP, 1,3-二磷酸甘油
酸在 3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH 作用下產(chǎn)生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸,340nm處的吸
光度變化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。 
自備實驗用品及儀器 
天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計、1 mL石英比色皿。 
3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase,PGK) 試劑盒說明書 試劑組成和配制       
提取液:液體100mL×1 瓶,4℃保存。 
試劑一:液體 25mL×1 瓶,4℃避光保存。 
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加 5mL 蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后
-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。 
試劑三:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加 2.5 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝
后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。 
試劑四:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加 2.5 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝
后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。 
試劑五:粉劑×1 瓶,-20℃避光保存。臨用前加 10 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝
后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。 
酶液提取 
①總 PGK酶提取:建議稱取約 0.1g樣本,加入 1mL 提取液,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,
200W,破碎3s,間歇7s,總時間 1min) ,然后 4℃,500g離心 5min,取上清測定。 
②胞漿和葉綠體 PGK 酶的分離:按照植物組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的
比例(建議稱取約 0.1g 樣本,加入 1mL 提取液),冰浴勻漿后于 4℃,500g 離心 5min,棄
沉淀,取上清在4℃,8000g離心 10min,取上清用于測定胞漿 PGK酶活性,取沉淀加1mL
提取液,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎 3s,間歇7s,總時間1min) ,然后 4℃,
500g離心 5min,取上清測定葉綠體中 PGK酶活性。 
建議測定總PGK酶活性,按照步驟①提取粗酶液,若需要分別測定胞漿和葉綠體中的PGK,
則按照步驟②提取粗酶液。 
測定操作 
1.  分光光度計預(yù)熱 30min,調(diào)節(jié)波長至 340nm,蒸餾水調(diào)零。 
2.  取 1mL石英比色皿,依次加入 500μL試劑一,100μL試劑二,50μL試劑三,50μL試劑
四,200μL試劑五,100μL粗酶液,充分混勻,記錄340nm處 10s的吸光值 A1和 310s
的吸光值 A2,△A=A1-A2 
 
3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase,PGK) 試劑盒說明書 計算公式 
(1)按照樣本蛋白濃度計算 
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 
PGK(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr 
(2)按照樣本質(zhì)量計算 
酶活單位定義:每克組織每分鐘消耗 1 nmol的 NADH 定義為一個酶活力單位。 
PGK(nmol/min /g  鮮重)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W 
V反總:反應(yīng)體系總體積,1mL;ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103
 L / mol /cm;d:比色
皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時
間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g   
 
 

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