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成纖維細胞的分離技術
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關 鍵 詞 | 成纖維細胞的,分離技術 |
- 【資料簡介】
實驗步驟
選擇大約一半足孕時間的胚胎,10-13天齡胚胎含有zui大數量的未分化的間質細胞,成纖維細胞可從這些細胞衍生獲得。1. 胚胎的分離1) 適用哺乳動物(倉鼠、小鼠和大鼠)a.采用認可的方案處死嚙齒動物b. 立即在無菌超凈臺內用70%乙醇擦洗整個動物。若可能,置紫外燈下照射5min。c. 用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口,用無菌鑷子將皮膚扯向后退。d. 用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部,去除含有胚胎的子宮,置于無菌的培養(yǎng)皿上e. 剔除胚胎周圍的包膜,將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的燒瓶中。f. 漂洗胚胎,去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。2) 適用雞胚胎a. 用70%乙醇擦洗雞蛋殼。b. 用無菌剪刀輕敲雞蛋的圓端,輕輕去除蛋殼露出氣囊。c. 用無菌鑷子去除覆蓋于絨毛尿囊上的白膜。d. 剪開包膜,用彎鑷夾住胚胎頸部去除胚胎。e. 棄頭部,將無頭的胚胎置于廣口燒杯中,用PBS漂洗。2. 將6-8個胚胎轉移至一個小的無菌廣口燒杯中,用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎,用PBS漂洗。3. 在無菌狀態(tài)下,將絞碎的胚胎轉移于一500ml的無菌的有攪拌棒的燒杯中,加入200-300ml用HBSS配制的0.25%的無菌*。4. 在溫暖的環(huán)境中或置于37℃培養(yǎng)箱中輕輕攪動15min。5. 讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降,將含有懸浮細胞的液體轉移至一無菌大容積的離心管中,該管內按照每10ml上清加入1ml牛血清的比例加入牛血清以滅火*。6. 加入新鮮*溶液(見前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的500ml燒杯中,重復步驟4和5。7. 離心混合的細胞懸液,1200r/min,5min,棄上清。8. 用新鮮的無菌PBS重懸沉淀的細胞,按步驟7再次離心。9. 用PBS反復洗滌細胞直至上清清亮為止。10. 用含有10%牛血清和抗生素(如*、*)的DMEM 10ml再懸沉淀,并使終體積為100ml。11. 讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質沉降?刹捎脭祵訜o菌紗布過濾細胞懸液以去除任何殘留的細胞快。12. 為確定現有細胞濃度,加入0.2ml細胞懸液于1.8ml 1%醋酸溶液中以裂解紅細胞,用*進行細胞計數。13. 按每10mm平皿1*107至4*107細胞的數量接種于10ml組織培養(yǎng)液中,在飽和濕度的37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育直至細胞鋪滿。14當細胞長滿后,去除培養(yǎng)液,用10%的溫暖的Versene(用PBS配制的0.53nmol/L EDTA),洗滌細胞層2次。15. 棄Versene,加入相同體積的溫暖0.05%*-EDTA。16. 37℃孵育5min。17. 用無菌吸管輕輕吹散細胞,并轉移至一含有1-2ml牛血清的無菌管中。牛血清的終濃度約為10%,起到中和*的作用。18. 離心,1200r/min,5min,棄上清。19. 再懸沉淀于5ml培養(yǎng)液中,另加入15ml培養(yǎng)液,分裝于2個100mm平皿中。20. 置37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞,直至細胞長滿,繼續(xù)步驟14-20以傳代細胞。
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