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技術(shù)中心

成纖維細胞的分離技術(shù)

2013年08月07日 08:39:41人氣:384來源:上海滬宇生物科技有限公司

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關(guān) 鍵 詞成纖維細胞的,分離技術(shù)
【資料簡介】

 實驗步驟

選擇大約一半足孕時間的胚胎,10-13天齡胚胎含有zui大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細胞,成纖維細胞可從這些細胞衍生獲得。
1. 胚胎的分離
   1) 適用哺乳動物(倉鼠、小鼠和大鼠)
a.采用認可的方案處死嚙齒動物
b. 立即在無菌超凈臺內(nèi)用70%乙醇擦洗整個動物。若可能,置紫外燈下照射5min
c. 用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口,用無菌鑷子將皮膚扯向后退。
 d. 用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部,去除含有胚胎的子宮,置于無菌的培養(yǎng)皿上
e. 剔除胚胎周圍的包膜,將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的燒瓶中。
 f. 漂洗胚胎,去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。
   2) 適用雞胚胎
 a. 70%乙醇擦洗雞蛋殼。
 b. 用無菌剪刀輕敲雞蛋的圓端,輕輕去除蛋殼露出氣囊。
 c. 用無菌鑷子去除覆蓋于絨毛尿囊上的白膜。
 d. 剪開包膜,用彎鑷夾住胚胎頸部去除胚胎。
e. 棄頭部,將無頭的胚胎置于廣口燒杯中,用PBS漂洗。
2. 6-8個胚胎轉(zhuǎn)移至一個小的無菌廣口燒杯中,用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎,用PBS漂洗。
3. 在無菌狀態(tài)下,將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一500ml的無菌的有攪拌棒的燒杯中,加入200-300mlHBSS配制的0.25%的無菌*。
4. 在溫暖的環(huán)境中或置于37培養(yǎng)箱中輕輕攪動15min。
5. 讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降,將含有懸浮細胞的液體轉(zhuǎn)移至一無菌大容積的離心管中,該管內(nèi)按照每10ml上清加入1ml牛血清的比例加入牛血清以滅火*。
6. 加入新鮮*溶液(見前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的500ml燒杯中,重復(fù)步驟45。
7. 離心混合的細胞懸液,1200r/min,5min,棄上清。
8. 用新鮮的無菌PBS重懸沉淀的細胞,按步驟7再次離心。
9. PBS反復(fù)洗滌細胞直至上清清亮為止。
10. 用含有10%牛血清和抗生素(如*、*)的DMEM 10ml再懸沉淀,并使終體積為100ml。
11. 讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降?刹捎脭(shù)層無菌紗布過濾細胞懸液以去除任何殘留的細胞快。
12. 為確定現(xiàn)有細胞濃度,加入0.2ml細胞懸液于1.8ml 1%醋酸溶液中以裂解紅細胞,用*進行細胞計數(shù)。
13. 按每10mm平皿1*1074*107細胞的數(shù)量接種于10ml組織培養(yǎng)液中,在飽和濕度的37 CO2培養(yǎng)箱中孵育直至細胞鋪滿。
14當(dāng)細胞長滿后,去除培養(yǎng)液,用10%的溫暖的Versene(用PBS配制的0.53nmol/L EDTA),洗滌細胞層2次。
15. Versene,加入相同體積的溫暖0.05%*-EDTA
16. 37孵育5min。
17. 用無菌吸管輕輕吹散細胞,并轉(zhuǎn)移至一含有1-2ml牛血清的無菌管中。牛血清的終濃度約為10%,起到中和*的作用。
18. 離心,1200r/min,5min,棄上清。
19. 再懸沉淀于5ml培養(yǎng)液中,另加入15ml培養(yǎng)液,分裝于2100mm平皿中。
20. 37飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞,直至細胞長滿,繼續(xù)步驟14-20以傳代細胞。

上海滬宇生物科技有限公司作者

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