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小鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)
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關(guān) 鍵 詞 | 小鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng),小鼠乳腺 |
- 【資料簡(jiǎn)介】
實(shí)驗(yàn)材料:
1. 10-12周齡妊娠小鼠乳腺組織
2. 不含Ca 2+ 和Mg 2+ 的1×PBS,添加200000IU/L、200mg/L和200000U/L,pH7.4
3. FBS、含5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS液或DMEM
4. 0.05%Ⅰ型膠原酶50ml、0.05%蛋白酶50ml、0.1%DNaseⅠ型、結(jié)晶紫(0.1%)/枸櫞酸(0.1mol/L)
5. 培養(yǎng)液:血清培養(yǎng)液(DMEM或F12+10%FBS)、無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM:F12為1:1,加胰島素1-5μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/ml、BSA1-5mg/ml等)。膠原凝膠鋪底液(酸性膠原液或自制鼠尾膠原,10×F12,用緩沖液稀釋?zhuān)?br>
6. 分化培養(yǎng)基:為DMEM/F12按1:1(體積比)比例配制的混合培養(yǎng)基,添加5μg/ml胰島素、1μg/ml、3μg/ml催乳素和50μg/ml。其中,催乳素以3μg/ml濃度溶于10mmol/L NaOH中,過(guò)濾除菌,4℃下可保存2周,使用前添加到培養(yǎng)基中。
7. C溶液:為9.6μg/ml的Dispase溶液,用DMEM配制。
8. 、解剖剪、解剖鑷、眼科剪,
9. 離心管(15ml、50ml)、10cm塑料培養(yǎng)皿、300ml有蓋的三角燒瓶(2個(gè),處理膠原酶及蛋白酶用)、高壓滅菌的帶尼龍網(wǎng)(孔徑150μm)的燒杯
10. 厚膠原膠的制備:以8:1:1(體積比)的比例配制鼠尾膠原、F12與NaHCO 3 /NaOH的混合液作為包被液。包被液的組分包括鼠尾膠原液、10×濃度的F12、0.26mol/L NaHCO 3 和0.125 mol/L NaOH混合液。分別除菌。將包被液和培養(yǎng)板在4℃下預(yù)冷。然后,按150μl/cm 2 的用量加到培養(yǎng)器皿內(nèi)。置37℃下1h,用培養(yǎng)液洗2次(每次30min),然后加入血清-胎球蛋白混合液。
實(shí)驗(yàn)方法:
1. 麻醉處死小鼠,75%乙醇消毒,置于蠟板上,用大頭釘固定四肢。用正中線剪開(kāi)皮膚,用鑷子引開(kāi)皮膚,用大頭針固定在板上。切下約5g乳腺脂肪組織,放入裝有PBS液的平皿內(nèi)洗滌3次。
2. 用刀片反復(fù)切割、或用剪刀剪碎乳腺至糊狀。然后將組織碎塊移至三角燒瓶?jī)?nèi),加50ml膠原酶,置37℃恒溫水浴中水平振蕩1-2h(100-200次/min)。
3. 當(dāng)無(wú)大片組織塊時(shí),用尼龍網(wǎng)將細(xì)胞濾至燒杯內(nèi),以除去未消化的組織。濾液移至5ml離心管內(nèi),1000r/min離心約3min,去上清,加PBS液2ml在手中振搖使細(xì)胞團(tuán)大散,移入裝有50ml膠原酶的三角燒瓶?jī)?nèi),這時(shí)會(huì)見(jiàn)部分細(xì)胞懸液中出現(xiàn)云霧狀,經(jīng)10-15min后會(huì)消失。放入37℃恒溫水浴中緩慢水平振搖30min(30次/min)。
4. 加10%血清或BSA約5ml,同上法用尼龍網(wǎng)過(guò)濾,以1000r/min離心約1min。向細(xì)胞團(tuán)中直接加血清或BSA約1ml,拍擊離心管,打散細(xì)胞團(tuán)(此時(shí)細(xì)胞脆弱,一般不進(jìn)行吹打)。移至10ml離心管中,加5mlPBS液混勻,以1000r/min離心約1min,洗滌細(xì)胞3次,可除去成纖維細(xì)胞和紅細(xì)胞。
5. zui后向細(xì)胞團(tuán)中加血清或BSA,打散細(xì)胞團(tuán),加5-10mlPBS液吹打10次左右,使其成為均一的細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。用此法分離的細(xì)胞多呈塊狀,很難正確計(jì)數(shù),必要時(shí)用0.1ml細(xì)胞懸液加0.9ml結(jié)晶紫,劇烈振搖細(xì)胞約1min,此時(shí)細(xì)胞易破壞而使胞核著色,可計(jì)數(shù)藍(lán)染細(xì)胞核數(shù)。每克組織約可收貨5×10 6 —10×10 6 個(gè)細(xì)胞。
6. 得到的細(xì)胞用含10%FBS的DMEM或無(wú)血清培養(yǎng)液懸浮,將上述消化的乳腺上皮細(xì)胞以密度為1.0×10 5 —2.5×10 5 個(gè)/cm 2 將其接種在厚膠原膠膜包被的培養(yǎng)板上,加入細(xì)胞分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
7. 培養(yǎng)72h,待細(xì)胞融合后,用移液器吸頭或細(xì)胞刮刷將膠原膜與培養(yǎng)板底面分離,使膠原膜收縮并漂浮在培養(yǎng)基中,之后每2-3d更換一次培養(yǎng)液。
8. 細(xì)胞傳代。消化溶液為10×-EDTA混合消化液,在37℃下孵育7min。另外,使用溶液作為消化液。操作如下:原代細(xì)胞培養(yǎng)后,用DMEM培養(yǎng)基洗培養(yǎng)板,再用1/4稀釋液(2.4μg/ml)的中性蛋白液洗培養(yǎng)板2次。加入100μl/cm 2 的Dispase溶液,于37℃靜置20min。再加入5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液以終止消化。
9. 再用含5%胎牛血清的DMEM/F12離心洗滌沉淀細(xì)胞(250r/min,4min)。離心后用5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。
10. 將細(xì)胞懸液以1.0×10 5 —2.5×10 5 個(gè)/cm 2 的細(xì)胞密度接種,培養(yǎng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。如果用于分化培養(yǎng),接種24-48h后可更換為分化培養(yǎng)基。
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