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理論上使用*選擇的親和純化抗體可得到高特異性，高敏感度的免疫測定。然而，由于經(jīng)濟(jì)原因或是缺乏合適的試劑，使得許多工作者采用低純度的制品，這種試劑通常含有與試驗(yàn)中其它成分起交叉反應(yīng)的抗體?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在用抗人IgG抗血清的抗體時(shí)，抗體中含有不需要的抗體交叉反應(yīng)。但當(dāng)使用親和純的抗血清時(shí)，交叉反應(yīng)不明顯。研究任何ELISA系統(tǒng)，為了控制不需要的交叉反應(yīng)，就要不惜使用親和純試劑。使用抗IgG血清抗體作為包被抗體，有時(shí)本底確實(shí)很低，但它的敏感度比僅使用親和純制品要低50-100倍。在高敏感度的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用封閉試劑是很重要的。zui終選擇非親和純抗IgG血清抗體是基于這樣設(shè)想：包被抗體或是結(jié)合的人IgG（抗原）與指示抗體有交叉反應(yīng)，則過量的與指示抗體同種動(dòng)物的血清，就可以封閉與酶標(biāo)抗體的不要的結(jié)合。然而人血清白蛋白中含有少量的IgA和IgG會干擾檢測。人血清白蛋白只適用于IgE的測定。同樣，不能用牛血清白蛋白。因?yàn)槠渲泻形⒘康呐gG。
抗血清抗體與親和純抗體對ELISA夾心法結(jié)果的影響可從下面實(shí)驗(yàn)看出：
實(shí)驗(yàn)A：包被抗體為粗制的綿羊抗人IgG抗體，指示抗體（檢抗）為粗制山羊抗人IgG抗體
實(shí)驗(yàn)B：包被抗體為親和純的綿羊抗人IgG抗體，指示抗體（檢抗）為粗制山羊抗人IgG抗體
實(shí)驗(yàn)C：包被抗體為粗制的綿羊抗人IgG抗體，指示抗體為親和純的山羊抗人IgG抗體
實(shí)驗(yàn)D：包被抗體和指示抗體都是親和純的兔抗人IgG抗體。
實(shí)驗(yàn)中使用5%血清（與指示抗體同物種來源）進(jìn)行封閉，其他夾心法ELISA步驟相同。
結(jié)果顯示，當(dāng)粗制的抗IgG血清抗體被用在夾心法的兩端（如實(shí)驗(yàn)a曲線）時(shí)，本底很高且曲線坡度不明顯。雖然能成功應(yīng)用此抗體類型，但問題是一種抗體結(jié)合另一種抗體?？赡馨l(fā)生了山羊指示抗體結(jié)合了綿羊包被抗體，因?yàn)橄♂屢褐械纳窖蜓暹^剩也不能降低本底值。當(dāng)應(yīng)用親和純化的包被抗體時(shí)（如實(shí)驗(yàn)b曲線），本底適當(dāng)降低而且形成了標(biāo)準(zhǔn)曲線。然而，大多數(shù)工作者認(rèn)為本底仍偏高，工作范圍有限（2-60ng/ml）。當(dāng)親和純的指示抗體與粗制包被抗體聯(lián)合使用時(shí)（如實(shí)驗(yàn)c曲線），本底大大較低，但敏感度約為100-200ng/ml，再者工作范圍仍受限。當(dāng)*使用親和純的抗體時(shí)（如實(shí)驗(yàn)d曲線），本底低，敏感度大大改善且工作范圍廣（2-500ng/ml）。
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