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逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常被用于檢測(cè)和量化樣本中的RNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)的*步是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄(RT)將不穩(wěn)定的RNA轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)的DNA(cDNA)。實(shí)際上，RT是許多用于研究RNA的分子生物學(xué)技術(shù)的*步，因?yàn)閷⒉环€(wěn)定的RNA轉(zhuǎn)換為更穩(wěn)定的DNA會(huì)使分析更容易、更可靠。對(duì)于RT-PCR,有一步法和兩步法。
在一步法RT-PCR中，RT反應(yīng)和PCR擴(kuò)增是在同一管中進(jìn)行。將RNA模板添加到試管中，加有兩種酶(逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶)，以及完成反應(yīng)的所有必須組分。逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生cDNA產(chǎn)物，然后逆轉(zhuǎn)錄酶和cDNA變性，DNA聚合酶擴(kuò)增cDNA。在一步法中，RT反應(yīng)由基因特異性引物啟動(dòng)。因此，只有感興趣的區(qū)域被反向轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行擴(kuò)增。
在兩步法RT-qPCR中，RT反應(yīng)與PCR擴(kuò)增單獨(dú)進(jìn)行。首先，RNA添加到反應(yīng)混合物中，混合物包括逆轉(zhuǎn)錄酶和oligo-dTs (結(jié)合mRNA的poly-A尾巴)或隨機(jī)六聚體(或兩者都有)，合成cDNA。下一步，從管子中取出少量cDNA，置于一個(gè)新管中，作為PCR的模板與基因特定的引物一起混合。因?yàn)镽T反應(yīng)采用隨機(jī)啟動(dòng)或由oligo-dTs進(jìn)行啟動(dòng)，總RNA或總mRNA在RT步驟中被轉(zhuǎn)錄。盡管這兩種方法都能得到zui終的結(jié)果，但是每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結(jié)它們的優(yōu)缺點(diǎn)。
一步法RT-PCR：
優(yōu)點(diǎn): 只需一步，反應(yīng)發(fā)生在單管中，速度比兩步法更快，而且需要較少的準(zhǔn)備和操作時(shí)間。
處理大量樣品時(shí)易于操作，減少污染的機(jī)會(huì)。
整個(gè)cDNA樣品都被擴(kuò)增，靈敏度更高。
缺點(diǎn): 同一樣本只有有限數(shù)量的目的基因被擴(kuò)增。另一個(gè)挑戰(zhàn)是組分的兼容性，因?yàn)橐徊椒ㄐ枰D(zhuǎn)錄和擴(kuò)增之間的平衡。
適用性：當(dāng)時(shí)間對(duì)于實(shí)驗(yàn)很重要時(shí)，一般采用一步法。例如，迅速的一步法是RNA病毒檢測(cè)的好方法，結(jié)果可以很快得到。也適用于高通量分析。 由于該方法采用基因特異性引物，所以通常是分析低表達(dá)水平基因的較好選擇。此外，一步法是非常的，需要測(cè)量表達(dá)水平上的細(xì)微差異時(shí)這是一種常用的方法。
兩步法RT-PCR：
優(yōu)點(diǎn): 可以分析同一樣本的多個(gè)目標(biāo)。
逆轉(zhuǎn)錄步驟將樣本中所有的RNA轉(zhuǎn)換為cDNA，可以儲(chǔ)存cDNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)大量基因。
能夠分別優(yōu)化RT和PCR步驟,可以更好地控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程。
因?yàn)橹挥猩倭康霓D(zhuǎn)錄材料用于PCR，任何可能從RNA分離到RT反應(yīng)的抑制劑（如乙醇、苯酚或胍鹽）都被稀釋了。
缺點(diǎn)：它更耗費(fèi)時(shí)間，且?guī)?lái)污染的可能性更高。RT步驟轉(zhuǎn)錄所有的RNA以相同的效率，選擇這種方法時(shí)，應(yīng)該考慮到啟動(dòng)會(huì)影響qPCR的結(jié)果。例如，以oligo-dTs 和隨機(jī)六聚體啟動(dòng)反應(yīng)可能會(huì)帶來(lái)不同的結(jié)果。因此，對(duì)于每個(gè)RT反應(yīng)應(yīng)該使用相同的條件。
適用性：選擇兩步方法的zui常見(jiàn)原因是對(duì)同一樣本的多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行分析。第二,當(dāng)RNA的存儲(chǔ)是個(gè)問(wèn)題時(shí),是進(jìn)行兩步RT-PCR，因?yàn)閏DNA在-20°C是穩(wěn)定的。此外，當(dāng)起始材料有*，使用兩步RT-PCR ，通常會(huì)有更高的cDNA產(chǎn)量。
