CAT#:D1600-50

 細(xì) 菌 DNAOUT /Bacterial DNAOUT使用說明書

產(chǎn)品及特點(diǎn) ：本產(chǎn)品可以用于絕大多數(shù)革氏陽性和陰性細(xì)菌基因組 DNA 的快速提取。

1. DNA 純凈，OD260/280 一般都在 1.9 左右，可直接用于 PCR、酶切、雜交等實(shí)驗(yàn)。

2. DNA 產(chǎn)量一般在 5-20 ug/mL 飽和菌液（10⁸-10⁹個(gè)細(xì)胞）。

3. 操作簡(jiǎn)單，整個(gè)過程約 15 分鐘，容易放量操作。

4. 每次提取可以處理 0.1-1.5 mL 的細(xì)菌，也可以使用菌落。

5. 安全無毒，本試劑盒對(duì)人體無害，無腐蝕性和刺激性氣味。

規(guī)格及成分:   成 份           編 號(hào)      50次包裝   250次包裝

             *         100406      600 mg       3 g

              溶液 A        D1600-50A   30 mL       150 mL

              溶液 B        D1600-50B   7.5 mL       40 mL

   RNase A 溶液（10mg/mL）  3160        0.75 mL      4 mL

運(yùn)輸及保存:常溫運(yùn)輸及保存（*需要-20℃保存）有效期一年。

自備試劑: 超純水、氯仿和 TE 緩沖液。

使用方法: 注意：溶液 A 和溶液 B 容易產(chǎn)生沉淀，溶液 B 比較粘稠，用前均需要放置在 65℃預(yù)熱使沉淀溶解、粘稠度降低，用前充分搖勻。

一: 對(duì)革氏陰性細(xì)菌樣品

1. 將 0.1-1.5 mL 過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 塑料離心管中， 12000-15000 g室溫離心 1 分鐘沉淀細(xì)菌，棄上清。

2. 加入 600 uL 預(yù)熱的溶液 A 到細(xì)菌沉淀中，充分吹打均勻。

3. 再加入 150 uL 預(yù)熱的溶液 B 到離心管中，顛倒數(shù)次混勻。此時(shí)溶液中可能有白色絲狀懸浮物產(chǎn)生。由于溶液 B 比較粘稠，可以采取稱量方法取用，150 uL 約等于 150-160 mg。也可以將 1 mL 槍頭剪去一截再吸取。也可以同時(shí)加入 15 uL的 RNase A 溶液。

4. 65℃放置 3-5 分鐘。如果室溫放置，DNA 產(chǎn)量會(huì)降低 10-20%。

5. 加入 200 uL 自備氯仿，震蕩混勻 10-30 秒，此時(shí)溶液將呈乳白色。

6. 12000-15000 g 室溫離心 2 分鐘。此時(shí)上清液將變得透明，中間層有白膜。小心轉(zhuǎn)移上清液到一個(gè)新的 1.5 mL 塑料離心管中，避免觸及中間層的白膜。

7. 加入 1 倍體積(約 750 uL)的異丙醇到上清液中，用手上下顛倒 30 秒混勻。此時(shí)一般將有絮狀 DNA 沉淀出現(xiàn)。

8. 12000-15000 g 室溫離心 3 分鐘。此時(shí)管底將有微小 DNA 沉淀，小心棄上清，注意不要丟棄 DNA 沉淀。

9. 在離心管中加 1 mL 75%乙醇，短暫震蕩，12000-15000 g 室溫離心 3 分鐘，棄上清。

10. 重復(fù)上述操作一次。

11. 短暫離心，小心吸棄殘留的液體（約 50 µL）。此步不要省略，否則殘留的液體（含

乙醇）將會(huì)影響 DNA 電泳、酶切很 PCR 等反應(yīng)。

12. 立即加入 50-100 µL TE 緩沖液充分溶解 DNA 沉淀。注意：由于基因組 DNA 較長(zhǎng)并在沉淀時(shí)形成緊密復(fù)合物，充分溶解的時(shí)間遠(yuǎn)長(zhǎng)于質(zhì)粒 DNA 或 PCR 片段，有時(shí)需要長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)。如果在第 3 步?jīng)]有加 RNase A 溶液，或雖然加了但還擔(dān)心有殘留的 RNA 污染，可以在此時(shí)補(bǔ)加 5-10 uL 的 RNase A 溶液，保溫 30 分鐘。

13. 直接取 5-10 uL 電泳檢測(cè) DNA，其余放冰箱備用。

二: 對(duì)革氏陽性細(xì)菌樣品

1. 將 0.1-1.5 mL 過夜培養(yǎng)的革氏陽性細(xì)菌 12000-15000 g 室溫離心 1 分鐘后, 重懸于 0.6 mL 溶菌液中（溶菌液配制:30 mL 超純水+600 mg *，配制后分裝成小管并放-20℃長(zhǎng)期保存，每次只用一小管)，顛倒混勻 5-10 次后放 37℃保溫至少 30 分鐘(有的革氏陽性菌種可能需更長(zhǎng)時(shí)間，需要自己根據(jù)不同的細(xì)菌摸索)。

2. 12000-15000 g 室溫離心 10 分鐘，小心棄上清。

3. 后續(xù)處理接上面的革氏陰性細(xì)菌提取步驟中的第 2 步。

三: 其他注意事項(xiàng)

1. 可以直接使用細(xì)菌菌落提取 DNA，操作時(shí)直接將細(xì)菌菌落挑入到溶液 A 中，后續(xù)操作同上。

2. 從單個(gè)菌落中提取到的 DNA 較少，所以只用 10-30 uL TE 溶解。

背景資料 

G+和 G-細(xì)菌細(xì)胞壁比較

細(xì)胞壁特性                      革氏陰性菌    革氏陽性菌

厚度                             10 nm         20-80 nm

細(xì)胞膜層數(shù)                        2              1

肽聚糖（Peptidoglycan）含量       10-20%          >50%

磷壁酸（Teichoic acid）             無              有  

脂及脂蛋白含量                   58%           0-3%

蛋白含量                          9%            0%

脂多糖（Lipopolysaccharide）含量    13%            0

對(duì)*敏感性                    低             高

對(duì)*（Lysozyme）敏感性        低             高