免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique )又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展*早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光實驗操作步驟：
一、固定和透化
1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的蓋玻片用1 × PBS浸洗3次，每次3 min。
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，1 × PBS浸洗玻片3次，每次3 min。
3. 0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室溫通透細胞15 min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟), 1 × PBS浸洗玻片3次，每次3min。
二、封閉
4. 吸水紙吸干1 ×PBS，在玻片上滴加5%的正常血清(與二抗種屬來源一致或相似)，室溫封閉1 h。
三、抗體孵育
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。
6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min。
注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
四、固定拍照
7. 復染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。
8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
