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原代細(xì)胞如何分離和培養(yǎng)?

時間:2025/2/5閱讀:17
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  用酶或機械方法直接從人或動物組織中分離出來的細(xì)胞。嚴(yán)格來說,從機體分離出來到傳代之前的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞,絕大部分的原代細(xì)胞在體外可以分裂10-15次(這與細(xì)胞的端粒長短有關(guān)),再加上取材,成本等因素,通常會把培養(yǎng)的第一代到第十代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞。
 
  原代細(xì)胞可用來轉(zhuǎn)染siRNA、antisense RNA、microRNA 等 200bp 以內(nèi)的小分子 RNA 和 DNA,可轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細(xì)胞。目前,無論國外還是國內(nèi),原代細(xì)胞的核酸轉(zhuǎn)染都是個熱點難題,市場還缺乏真正有效的商品化的原代細(xì)胞核酸轉(zhuǎn)染試劑。原代細(xì)胞能夠高效轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細(xì)胞,獲得比較理想的基因敲除效果。甚至對一些活體寄生蟲幼蟲,也能獲得較為理想的轉(zhuǎn)染結(jié)果。對于大多數(shù)原代細(xì)胞,RFect PM 細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽性率都在80%以上,而轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率不到 10%。
 
  原代細(xì)胞分離和培養(yǎng)基本步驟:
 
  1、器官和組織的選擇
 
  盡可能的去除不必要的組織和血跡。
 
  2、原代細(xì)胞的分離
 
  (1)應(yīng)用PriCells原代細(xì)胞分離試劑盒I、II、III。
 
  (2)根據(jù)組織來源不同,可選用不同的PriCells原代細(xì)胞分離試劑盒。
 
  3、原代細(xì)胞的培養(yǎng):
 
  (1)PriCells原代細(xì)胞特制培養(yǎng)基
 
  (2)PriCells原代細(xì)胞特制添加物
 
  (3)優(yōu)質(zhì)胎牛血清
 
  4、細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定:
 
  PriCells原代細(xì)胞鑒定試劑盒
 
  5、原代細(xì)胞的傳代、保存
 
  (1)傳代:依椐細(xì)胞的生長狀態(tài),生長的細(xì)胞1:2或1:3進(jìn)行傳代。
 
  (2)保存:DMSO+培養(yǎng)液+血清
 
  按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→超低溫冰箱(-80℃過夜)→液氮。
 
  6、原代細(xì)胞的復(fù)蘇
 
  (1)取出細(xì)胞,迅速放入37℃溫水中快速解凍。
 
  (2)吸出細(xì)胞懸液,并加10倍以上培養(yǎng)液。
 
  (3)用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種培養(yǎng)瓶,放入37℃CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
 

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