?測定步驟：

1.加樣
1. 除包被外都需45度加樣
2.加樣體積要準(zhǔn)確
3.管底加樣，不能加在管壁上
4.加樣時(shí)不能產(chǎn)生氣泡
2.溫浴
1.加標(biāo)本后和加結(jié)合物后，應(yīng)立即放入按規(guī)定的反應(yīng)溫 度的水浴箱。
2.各ELISA板不應(yīng)疊在一起。
3.為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕 紗布的金屬濕盒中。
4.加入底物后，反應(yīng)的時(shí)間和溫度通常不做嚴(yán)格要求。 如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，以便 不時(shí)觀察，待對(duì)照管顯色適當(dāng)時(shí)，即可終止酶反應(yīng)。
3.洗滌
1.洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)步驟，但卻 是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。
2.目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或 抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特 異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
4.讀板
1.陰性對(duì)照顏色極淺，在定性測定中一般 可采用目視比色。
2.如用酶標(biāo)儀測定結(jié)果，準(zhǔn)確性決定于 ELISA板底的平整與透明度、酶標(biāo)儀的質(zhì) 量和軟件的算法。

樣品收集、處理及保存方法：
1、   血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2、   血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、   細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。
4、   組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
5、   保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

標(biāo)本要求：
1. 血清：：溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
3. 尿液：無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，或組織蛋白萃取試劑，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿化。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測過程中除正常反應(yīng)外，有時(shí)常見到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：
①標(biāo)本因素；
②試劑因素；
③操作因素。
下面就一些常見ELISA操作過程中的問題一一分析。
1．樣品稀釋 酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清不稀釋，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性。因此，國外檢測血清抗體的試劑盒，均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗(yàn)確定，以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。但是，有些用戶未能嚴(yán)格按使用說明書操作，如某些產(chǎn)品應(yīng)取10μl樣品進(jìn)行稀釋，個(gè)別用戶取5μl甚至1μl樣品進(jìn)行稀釋，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠，因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，檢測結(jié)果出現(xiàn)問題。
2．試劑盒平衡 試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫（約25℃），一般需在室溫放置20～30分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。 
3．樣品和試劑的混勻 稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗(yàn)的均一性。
下列是公司是正在的產(chǎn)品：

兔抗人、大、小鼠化間變型淋巴瘤激酶IgGNeuropeptideY(18-36)

肝再生增強(qiáng)因子IgGPancreaticPolypeptide(1-17)-(Ala31,Aib32)-NeuropeptideY

谷氨氨基轉(zhuǎn)移酶1IgGNeuropeptideY(22-36)

α－基?；窱gGMelanin-ConcentratingHormone(salmon)

短鏈L-3羥烷基脫酶人IgG(D-Arg6,Asn10)-MCH(6-16)amide(human,mouse,rat)

短鏈L-3羥烷基脫酶大鼠，小鼠IgG(D-Bpa13,Tyr19)-Melanin-ConcentratingHormone(human,mouse,

?；撁搁L鏈IgG(Phe13,Tyr19)-Melanin-ConcentratingHormone(MCH)(human,m

?；撁负荛L鏈IgGMCH-Gene-Overprinted-Polypeptide-14(rat)

?；撁钢墟淚gGNeuropeptideEI(human,mouse,rat)

神經(jīng)元突觸前膜蛋白IgGMelanostatin

腺苷單活化蛋白激酶α1IgG(D-Leu2)-Melanocyte-StimulatingHormone-ReleaseInhibitingF

兔抗人、大、小鼠腺苷單活化蛋白激酶α2IgG(Tyr0)-Melanocyte-StimulatingHormone-ReleaseInhibitingFac

化腺苷單活化蛋白激酶α1IgGTyr0,Trp2)-Melanocyte-StimulatingHormone-ReleaseInhibiting

腺苷單活化蛋白激酶β2IgGMIF-1-Gly

化腺苷活化蛋白激酶γ1IgGEEKLIVVAF
GlyCAM-1檢測試劑盒 （標(biāo)準(zhǔn)品）RabbitAnti-MouseIgGH&Lpreadsorbed

（標(biāo)準(zhǔn)品）RabbitAnti-MouseIgGH&L(FITC)preadsorbed

（標(biāo)準(zhǔn)品）RabbitAnti-MouseIgGH&L(TRITC)preadsorbed

（標(biāo)準(zhǔn)品）RabbitAnti-MouseIgGH&L(TexasRed®)preadsorbed

（標(biāo)準(zhǔn)品）RabbitAnti-MouseIgGH&L(Biotin)preadsorbed

（標(biāo)準(zhǔn)品）RabbitAnti-MouseIgGH&L(HRP)preadsorbed

鈉（標(biāo)準(zhǔn)品）RabbitAnti-MouseIgGH&L(AlkalinePhosphatase)preadsorbed

巴卡III（標(biāo)準(zhǔn)品）DonkeyAnti-RabbitIgGH&L(FITC)preadsorbed

（標(biāo)準(zhǔn)品）DonkeyAnti-RabbitIgGH&L(TRITC)preadsorbed

（標(biāo)準(zhǔn)品）DonkeyAnti-RabbitIgGH&L(TexasRed®)preadsorbed

(標(biāo)準(zhǔn)品)DonkeyAnti-RabbitIgGH&L(Biotin)preadsorbed

雜質(zhì)A（標(biāo)準(zhǔn)品）DonkeyAnti-RabbitIgGH&L(HRP)preadsorbed

(標(biāo)準(zhǔn)品)DonkeyAnti-RabbitIgGH&L(AlkalinePhosphatase)preadsorbed

白藜蘆醇（標(biāo)準(zhǔn)品）GoatAnti-RabbitIgGH&Lpreadsorbed

（標(biāo)準(zhǔn)品）GoatAnti-RabbitIgGH&L(FITC)preadsorbed

實(shí)驗(yàn)原理：
是采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。