運(yùn)輸和保存：

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

商品信息：

細(xì)胞介紹：

　　該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶 YFP 基因。

　　細(xì)胞特性

　　1） 來源：人胃癌

　　2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)

　　3） 含量：>1x10^6 細(xì)胞數(shù)

　　4） 規(guī)格：T25 瓶或者 1mL 凍存管包裝

　　5) 用途：僅供科研使用。

　　細(xì)胞篩選：

　　該細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 YFP 的細(xì)胞，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其 YFP 熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱。若實(shí)驗(yàn)要求需要維持熒光強(qiáng)度，可以加入嘌呤霉素進(jìn)行再次篩選。 建議收到細(xì)胞后至少傳 3 代，凍存留種后再進(jìn)行篩選。

　　初次進(jìn)行細(xì)胞篩選時(shí)，建議加入終濃度為 1ug/ml 嘌呤霉素的培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，若無細(xì)胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含 2ug/ml 嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，以此類推，至藥物濃度為 5ug/ml。

　　若篩選過程中，漂浮細(xì)胞大于 60%，則停止篩選，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞密度約 80%，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進(jìn)行篩選。當(dāng)加入 5ug/ml嘌呤霉素時(shí)細(xì)胞正常增殖，可停止篩選，用不含藥培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

　　運(yùn)輸和保存：干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：

　?。?/span>1）1mL 凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80 度

　　冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)

　　胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

　　（2）T25 瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

　　細(xì)胞接收后的處理：

　　1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將 T25 瓶置于 37℃培養(yǎng)箱放置約 2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

　　2）請(qǐng)?jiān)?4 或 5X 顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各 2-3 張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

　　3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在 37℃培養(yǎng)箱中放置 2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在 60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的培養(yǎng)基 6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá) 70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。

　　4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說明書細(xì)胞培

　　養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。 收到細(xì)胞后第一次傳代建議 T25 培養(yǎng)瓶 1：2 傳代。

　　細(xì)胞培養(yǎng)步驟

　　一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

　　1）準(zhǔn)備 DMEM 培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。 2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　二．細(xì)胞處理：

　　1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：

　　將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含 4-6mL 培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在 1000RPM 條件下離心 3-5min，棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含 6-8ml 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中 37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

　　2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

　　對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

　　1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。

　　2. 加入 0.25％（w / v）胰dan白酶-0.53 mM EDTA 于培養(yǎng)瓶中（T25 瓶 1-2mL，T75 瓶 2-3mL），置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入 3-4ml 含 10%FBS 的培養(yǎng)基來終止消化。

　　3.輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按 1：2 的比例分到新 T25 瓶中，添加 6-8ml 按照說明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按 1:2~1:5 的比例進(jìn)行。

　　3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前 3 代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。下面T25 瓶為例；

　　1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為 1×10^6~1×10^7個(gè)活細(xì)胞/ml.

　　2. 1000rpm 離心 3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每 1ml 凍存液含 1×10^6~1×10^7個(gè)活細(xì)胞/ml 分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

　　3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80 度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

　　注意事項(xiàng)：

　　1. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

　　2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會(huì)泄漏，并會(huì)慢慢充滿液氮。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害。

細(xì)胞接收后的處理：

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。

公司正在出售的產(chǎn)品：

細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。