大鼠角膜成纖維細(xì)胞提取物【Rat Eye: Normal Corneal FibroblastsDerivatives】
大鼠角膜成纖維細(xì)胞提取物是從大鼠原代角膜成纖維細(xì)胞提取的，大鼠原代角膜成纖維細(xì)胞從正常大鼠眼組織制備。所有的產(chǎn)品在發(fā)貨之前均經(jīng)過嚴(yán)格的QA/QC流程以確保其質(zhì)量。這些產(chǎn)品可以直接用于基因克隆，表達(dá)圖譜分析以及各種分子生物學(xué)實驗的研究。
總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit進(jìn)行純化。公司提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測定結(jié)果等。

cDNA制備：純化后的總RNA來合成cDNA一鏈，以50ul總反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物以及10mg總RNA。68℃反應(yīng)10min 后終止RT反應(yīng)。利用1x RT Buffer 運輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應(yīng)。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過了嚴(yán)格的QA/QC分析，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。

蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備大鼠角膜成纖維組織裂解液，離心去除組織碎片，通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF，-80度保存。

潛在的應(yīng)用： <1>已知基因的PCR克隆；<2>mRNA選擇性剪接；<3>基因克隆與目標(biāo)測序；<4> Western and Northern Blot；<5>蛋白檢測與蛋白質(zhì)組學(xué)；<6>芯片研究與表達(dá)圖譜。

操作要點：
1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。
5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實驗。
注意事項：
1. 接收到細(xì)胞，肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細(xì)胞100X,200X各一張）。
2.用75%的酒精消毒（建議配置75%的酒精的水是滅菌過的）。
3.嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4.將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴(yán)禁直接傾倒），放入另一無菌容器中（建議換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞）。
5.用PBS 2-3ml/次輕輕洗細(xì)胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%-EDTA1-1.5ml,顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，輕輕拍打培養(yǎng)瓶直到細(xì)胞脫落，加入終止液終止。
6.1000rpm，5min離心，重懸細(xì)胞。
7.換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)。 

N(ALPHA)-(2 4-DINITRO-5-FLUOROPHENYL)-6種鄰苯二酸酯混標(biāo)(DINP，DEHP，DNOP，DIDP，BBP，Danti- KCNAB1 antibody蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3(PDIA3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

1-Methyl-L-histidine6種鄰苯二酸鹽混標(biāo)anti- KCNAB2 antibody蛋白二硫化物異構(gòu)酶A2(PDIA2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

Glyphosate歐盟6種鄰苯二酸酯混標(biāo)（DEHP、DBP、BBP、DINP、DNOP、anti- KCNB1-Specific antibody載脂蛋白B100(APOB100)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

N-CHLOROCARBONYL ISOCYANATE6種鄰苯二酸鹽混標(biāo)anti- KCNC4 antibody載脂蛋白E(APOE)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

N-(tert-Butyldimethylsilyl)-N-methyl-trifluoroacetamide歐盟7種鄰苯二酸酯混標(biāo)（DEHP、DBP、BBP、DINP、DNOP、anti- KCNE1 antibody載脂蛋白A1(APOA1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

N,2,3-Trimethyl-2-isopropylbutamide歐盟7種鄰苯二酸酯混標(biāo)（DEHP、DBP、BBP、DINP、DNOP、anti- KCNE4 antibody白介素2(IL2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

Pentamethyldiethylenetriamine7種鄰苯二酸酯混標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)品anti- KCNF1 antibody干擾素γ(IFNγ)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylenediamine6種鄰苯二酸酯混標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)品anti- KCNH7 antibody內(nèi)臟脂肪特異性蛋白酶抑制因子(Vaspin)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

大鼠角膜成纖維細(xì)胞提取物Penicillium thomii Maire, anamorphKT3 tag抗體Human AGRP(Agouti-related protein) ELISA Kit橋尾蛋白(GPHN)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..1抗體Human SLPI(Secretory leukocyte protease inhibitor) ELISA Kit糖蛋白A33(GPA33)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

Vibrio parahaemolyticus (Fujino et al.) Sak ..4抗體Human CDH5(Cadherin-5) ELISA Kit高爾基蛋白3(GOLPH3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

Pyrenophora trichostoma (Fries) Fckel, tel ..轉(zhuǎn)染抑癌基因KLF6抗體Human APCS(Serum amyloidP-component) ELISA Kit高爾基體蛋白B1(GOLGB1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

Candida albicans (Robin) Berkhout7抗體Human IFNW1(Interferon omega-1) ELISA Kit高爾基體蛋白A1(GOLGA1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

Acidiphilium acidophilum (Guay and Silver) ..9抗體（9）Human CASP1(Caspase-1) ELISA Kit高爾基體蛋白A2(GOLGA2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

Staphylococcus epidermidis (Winslow and Win ..14抗體Human ANGPTL3(Angiopoietin-related protein 3) ELISA Kit高爾基體蛋白A3(GOLGA3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

Mesoplasma seiffertii (Bonnet et al.) Tully ..鉀電壓閥門通道混合器相關(guān)亞家族成員7抗體Human SOST(Sclerostin) ELISA Kit高爾基體蛋白A4(GOLGA4)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)

培養(yǎng)步驟：

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞|細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。