酵母焦磷酸酶

無機(jī)焦磷酸酶（酵母）純化自重組 E. coli 菌株，攜帶有從釀酒酵（Saccharomycescerevisiae）克隆的 ppa基因和蟾分枝桿菌（Mycobacterium xenopi）GyrA 內(nèi)含肽的融合基因。該焦磷酸酶催化無機(jī)焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽：–4+ H20 →2HP04–2。在核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，可解除生成的無機(jī)焦磷酸鹽對(duì)反應(yīng)體系的抑制。
應(yīng)用
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中提高 RNA 產(chǎn)量
增強(qiáng) DNA 復(fù)制
儲(chǔ)存：-20°C 可保存 3 年。
活性定義：

1 單位指標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下（20 mM Tris-HCl，pH7.5，2 mM MgCl2，2 mM PPi，25°C 反應(yīng) 10 分鐘）每分鐘催化無機(jī)焦磷酸鹽生成 1 μmol 磷酸鹽所需的酶量。
使用注意事項(xiàng)：
（1） 該酶在多種反應(yīng) Buffer 中均具有活性，通常該酶在HDA 擴(kuò)增、LAMP 擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)中，可直接接入即可。
（2） 該酶的用量在不同的實(shí)驗(yàn)中需要優(yōu)化，通常在0.05~1 U/ml 濃度調(diào)整。
（3） 該酶的反應(yīng)溫度為 25°C，其在 16~37°C 均有活性，65°C 10min 可使該酶失活。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，第鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。