Ribonuclease R(Rnase R) 核酸外切酶

RNase R 來(lái)源于 E.coli，通過(guò)基因工程重組表達(dá)，該酶為 Mg2+依賴的 3’-5’核糖核酸外切酶。其可消化所有線性 RNAs 底物，但不能消化環(huán)狀 RNA(circular RNA)、套索 RNA(lariat RNA)、雙鏈 RNA、3’突出端<7nt 的雙鏈RNA。本酶可高效的去除不含二級(jí)結(jié)構(gòu)的線性 RNA，從而純化獲得環(huán) RNA 分子，用于后續(xù) RNA-sequencing 等實(shí)驗(yàn)。
活性定義：在 20 mM Tris-HCl(pH7.5)，100 mM KCl，0.5mM Mg2+條件下, 37°C 下水解 1 μg 的 poly-r(A)產(chǎn)物，所需酶量為 1 個(gè)活性單位。10xRNase R Buffer：200 mM Tris-HCl, 1 M KCl，5 mM
MgCl2，pH7.5
酶儲(chǔ)存液：20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT ,50% Glycerol, 0.1% (w/v) Tween-20, pH 7.5。
儲(chǔ)存：置于-20°C 可保存 3 年，避免反復(fù)凍融。
使用方法
1. 配制反應(yīng)體系
RNA 1-10 μg
10xRNase R Buffer 2.5 μl
Rnase Inhibitor (40 U/μl) 0.5 μl
RNase R (20 U/μl) 1-2 μl
DEPC-treated Water up to 25 μl
2. 37℃孵育 30-60min，反應(yīng)完畢后可加入 5 mM EDTA終止反應(yīng)。
使用注意事項(xiàng)：
(1) 在 total RNA 的消化中，由于含有二級(jí)結(jié)構(gòu)較多的RNA，如 tRNA、rRNA、dsRNA 等，RNase R 對(duì)該類底物消化活性大幅下降，此時(shí)需要延長(zhǎng)消化時(shí)間至 2h，并在 1h 時(shí)補(bǔ)加 RNase R 進(jìn)行消化。必要時(shí)將反應(yīng)溫度提高至 45℃，以打開含有二級(jí)結(jié)構(gòu)的 RNA 分子。
(2) 對(duì)于含有 highly structured 的 RNAs，RNase R 仍然無(wú)法消化， 稍后將推出 5’-3’的核糖核酸外切酶以解決此類問(wèn)題。
(3) 據(jù)其它文獻(xiàn)報(bào)道，在含有 highly structured 的 RNAs，可放大反應(yīng)體積至 50 μl，可降低二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，從而促進(jìn) RNA 的降解。
(4) 高溫和長(zhǎng)時(shí)間的孵育，可能導(dǎo)致 RNA 的非酶性斷裂（水分子的 H+對(duì)二酯鍵的攻擊）。因此，消化時(shí)間、反應(yīng)溫度均需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，第鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。