核酸外切酶I(E.coli)

該酶具有從 3’-5’ 方向降解單鏈 DNA 的外切酶活性，能夠逐步釋放脫氧核糖核酸 5'單磷酸，并留下完整的 5'端二核苷酸。該酶來源于攜帶有 E. coli exo I 基因的質(zhì)粒，經(jīng)重組表達(dá)純化而得。該酶多用于 PCR 擴(kuò)增后降解消化引物，該酶對于雙鏈 DNA 和磷?；蛞阴；鶊F(tuán)封閉的 3’OH 末端 DNA 鏈無活性。

應(yīng)用
從 PCR 混合物中去除引物PCR 產(chǎn)物測序之前用于在單管中使用大引物進(jìn)行的PCR 誘變反應(yīng)從核酸混合物中去除含有 3'羥基末端的單鏈 DNA檢測含有 3'羥基末端的單鏈 DNA 的存在
儲存：-20℃可保存 3 年。
活性定義：1 單位指在 37°C 條件下，30 分鐘內(nèi)催化釋放10 nmol 的酸溶性核苷釋放所需要的酶量。
使用注意事項(xiàng)
（1）1×ExoI Buffer：67mM Glycine-KOH pH 9.5，6.7mMMgCl2，10mM 2-巰基yi醇。該酶在常規(guī) PCR Buffer 中也具有活性。
（2）該酶的反應(yīng)溫度為 37°C，80°C 20min 可失活。
（3）該酶不能切割雙鏈 DNA，因此含有二級結(jié)構(gòu)的單鏈DNA 需要變性后才能消化。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。