UNG (Uracil N-Glycosylase)

niao嘧啶 DNA 糖基酶(Uracil N-Glycosylase,UNG)又名 Uracil-DNA Glycosylase, UDG, 來源于 E. coliuracil N-glycosylase 基因的重組表達，分子量為 26kDa。其可催化含niao嘧啶的單鏈和雙鏈 DNA 釋放游離niao嘧啶。
它對 RNA 無活性，主要應用于 PCR 擴增產物的防污染。
它的作用原理基于：如果在 PCR 反應中以 dUTP 替代dTTP摻入DNA 中，形成了含 dU 堿基的 PCR 擴增產物，該酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈 DNA 中 U 基的糖苷鍵，降解該 PCR 擴增產物。

活性定義：在標準 PCR 反應體系下，37℃條件下，1 小時降解 1μg 含 dU 堿基的單鏈 DNA 的酶量為 1 活性單位。
反應 Buffer：UNG與絕大多數的PCR 聚合酶反應緩沖液都是兼容的，但在高離子濃度(>100mM)下活性會受到抑制。
酶儲存液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50%Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。
儲存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反復凍融。
熱失活：95°C，5min。
操作方法
1.配制反應體系
Super Taq DNA Polymerase 0.5 μl
dNTP/dUTP Mixture 2~4 μl
10XHi PCR Buffer 5 μl
Uracil N-Glycosylase (5U/μl) 0.2~0.5 μl
Primers (10μM each ) 1 μl
Template DNA 10 ng-1 μg
DEPC-treated Water up to 50 μl
2. PCR 擴增循環(huán)參數
循環(huán)數 溫度 時間
去污染 50°C 2min
熱失活 95°C 5min
30-40 Cycles
95°C 20s
50~60°C 20s
72°C 1kb/1min
Last Cycle 72°C 5min

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，第鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。