Dnase I(Rnase free)

該酶是將單鏈或雙鏈 DNA 同等程度的隨機分解，生成具有 5′-P 末端寡核苷酸的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶。由于RNase-free DNase I 中 Protease 已幾乎被去除，從而提高了該酶在 pH 中性區(qū)域的穩(wěn)定性。此外該酶中添加了
Rnase Inhibitor，用于抑制 RNA 樣品中殘留的 RNase 核酸酶，因此可以有效抑制 RNA 提取過程中 Rnase 酶對 RNA的降解。Stop Buffer 終止反應(yīng)后，可通過一步加熱失活DNase I 活性。

活性定義
在 50 μl 體系下，37℃ 10min 條件下消化 1 μg pBR322質(zhì)粒 DNA 所需的酶量定義為 1 個活性單位。純度
2 U 的本酶和 1 μg 的 16S, 23S rRNA 在 37℃、pH7.5 的條件下反應(yīng) 1 小時，RNA 的電泳譜帶不發(fā)生變化
應(yīng)用：去除 RNA 樣品中的 DNA 污染。
儲存：-20°C 可保存 2 年。
操作方法（去除 RNA 中的基因組 DNA 污染）
1. 按以下組分配制反應(yīng)體系
RNA 1~50 μg
10× RD Buffer 2 μl
Rnase Free DNase I (2 U/μl) 1 μl*
Rnase Free H2O Up to 20 μl
*若 RNA 樣品中含有超過 5 μg 基因組 DNA 污染，請使用2 μl 該酶。
2. 37°C 孵育 15min 以消化去除基因組 DNA。
3. 孵育完畢后加入 2 μl 10× RD Stop Buffer，混合均勻室溫放置 1min，并置于 75°C 10min 加熱失活 DNase I。樣品可直接用于下一步反轉(zhuǎn)錄等試驗。
注意：
1）通常加熱方法即可失活 DNase I。如需要去除殘留的變性蛋白，可在 37°C 消化完畢后使用酚氯仿抽提并沉淀 RNA樣品（不進行加熱操作）。
2）10× RD Stop Buffer 中含有螯合劑用于去除二價陽離子，進行加熱失活前，必須加入 2 μl 10× RD Stop Buffer 并混合均勻，再進行熱失活，否則會導致 RNA 降解。
3）處理完畢的 RNA 樣品進行一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時，添加量需要<20%（如 20 μl 的反轉(zhuǎn)錄體系中加入量要<4 μl）

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，第鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。