Equi-phi29 DNA Polymerase

描述：Equi-phi29 DNA Polymerase 是 phi29 的改造體，并 經(jīng)多次純化分離而得。在保留了 phi29 DNA 聚合酶的鏈置 換、連續(xù)合成特性（>70kb）的基礎(chǔ)上，提高了滾環(huán)擴(kuò)增的 反應(yīng)溫度，該酶酶可以在 42 度條件下持續(xù)的進(jìn)行 DNA 合成 （而 phi29 DNA 聚合酶在此溫度下反應(yīng)活性很低）。 這種高溫的反應(yīng)特性，在以下幾個(gè)方面對(duì)實(shí)驗(yàn)有明顯的 提升：（1）在 NGS 測(cè)序中，其提升了高 GC 含量、回文結(jié) 構(gòu)等復(fù)雜模板的延伸能力，使得 NGS 的覆蓋度更均一，降 低測(cè)序所需深度；（2）高溫的反應(yīng)條件，提升了基因組 DNA 的 WGA 產(chǎn)物的合成量，并可以進(jìn)行變溫?cái)U(kuò)增；（3）降低測(cè) 序中 Gap 區(qū)域，提升單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量和完整度；（4） 降低非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；（5）提升 MDA/RCA 等實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增 性能和特異性。 除此外，該酶仍然具有很強(qiáng)的 3’→5’外切酶校讀功能， 合成的 DNA 片段保真性高。該酶的外切酶活性較強(qiáng)，因此 合成過(guò)程中引物需要 3’端硫代修飾，以降低外切活性對(duì)引物 的切割效應(yīng)。

儲(chǔ)存：-20℃可保存 3 年。
使用方法
1. 配制引物模板退火體系
10×phi29 Buffer 2 μl
dNTP Mixture (10 mM each) 1.2 μl
Template DNA 0.1-40 ng
硫代修飾的Oligo x μl
ddH2O Upto 19 μl
注意：在不同的實(shí)驗(yàn)類(lèi)型中，Oligo根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行選擇。
2. 引物和模板退火：體系配制完畢后，放置到 PCR 儀中，95℃ 3min，25℃ 3min。
3. 退火完畢后，向退火產(chǎn)物中加入 1μl Equi-phi29 DNAPolymerase，混合均勻。
4. 擴(kuò)增反應(yīng)
4.1 恒溫?cái)U(kuò)增
對(duì)于環(huán)狀DNA模板采用恒溫反應(yīng)作為推薦使用30℃恒溫?cái)U(kuò)增，30℃孵育 6~16h.該酶在 30-42℃條件下均可工作，必要時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型進(jìn)行調(diào)整。
4.2 變溫?cái)U(kuò)增
對(duì)于基因組 DNA 或 cDNA 模板，推薦使用變溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，以在短時(shí)間內(nèi)獲得更高產(chǎn)量，并提高了低濃度模板的擴(kuò)增產(chǎn)量。在 PCR 儀上做如下設(shè)置：
【30℃ 5min；42℃ 15s】循環(huán) 72 次（約 6h）或 120次（約 10h）.必要時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，可于 65°C 10min 進(jìn)行失活反應(yīng)。
使用注意事項(xiàng)
（1）必要時(shí)可單獨(dú)額外添加終濃度 1 mM DTT 和 0.2mg/ml BSA，可提高反應(yīng)效率。
（2）該酶的反應(yīng)溫度為 42 ℃ （在 30~42℃之間均有活性）。
（3）65℃ 10min 即可使該酶失活。
（4）根據(jù)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型需要，調(diào)整dNTP的濃度100~500 μM。
（5）添加 Yeast Pyrophosphatase可提高 DNA 產(chǎn)量。
（6）反應(yīng)引物 3’端的硫代修飾可避免引物降解。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。