RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG)

描述：RAPA3G Probe qPCR MasterMix 將熱啟動 RAPA3GDNA 聚合酶、反應(yīng) Buffer、dNTP 染料等試劑預(yù)混在一起，是一種 2×濃度的單組分預(yù)混試劑。該制品不含有 ROX 校正染料，適用于各種熒光標(biāo)記探針，并且適用于各種定量 PCR機型。優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，使得該制品可用于單重及多重的探針法定量 PCR。制品中的 RAPA3G DNA 聚合酶為第三代 DNA 聚合酶，其具有高的雜質(zhì)耐受性，其對乙醇、胍鹽、肝素、血清、植物多糖多酚具有的耐受性，因此可用于粗樣品的直接定量 PCR 檢測(Direct PCR)。該酶經(jīng)化學(xué)法修飾，在 50℃以下 無活性，只有 95 度條件下加熱 5min 后才能恢復(fù)酶的活力。因此該系統(tǒng)可以有效抑制非特異性 PCR 擴增，極大的提高了 PCR 擴增特異性。由于 RAPA3G DNA 聚合酶對 dUTP 具有的識別能力，該制品中的 dTTP 核酸堿基被 dUTP 所取代，因此擴增產(chǎn)物均包含 dUTP，在配合熱敏 UDG（該酶在 95℃熱變性 5min 后不可逆失活，不影響后續(xù) PCR 反應(yīng)）的條件下能達到佳的防污染能力。在 10e5 copies 污染物的測試條件下，Ct 推遲 15 個以上（污染去除能力>99.997%）。
儲存：-20℃可保存 2 年。短期使用可放置 2-8℃，保存 3 個月。如出現(xiàn)白色沉淀溶解后使用，不影響反應(yīng)性能。該試劑經(jīng) 30 次凍融后性能無下降，因此不使用時請置于-20℃避光保存。
RAPA3G DNA 聚合酶對抑制物耐受性
SDS 0.01% Serum 2%
EtOH 5% Plasma Citrate 2%
Heparin 0.1IU/ml Gua SCN 0.25%
Hematin 30μM Trizol 0.5%
操作方法
1、按照如下組分配制 20 μl PCR 反應(yīng)體系：
終濃度
2×RAPA3G Probe MasterMix(with UDG) 10 μl 1×
Primer F1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Primer R1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Probe1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
其它引物和探針 X
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 進行 Real-Time PCR 反應(yīng),通常采用兩步法，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 熱啟動
Stage 3
40 循環(huán)
95℃ 5 s 變性
60℃ 30 s 收集信號 退火/延伸
注意：退火延伸溫度可在 55-65℃調(diào)整
3. 在多數(shù)情況下，采用兩步法程序可獲得理想的擴增效果，在無法達到預(yù)期理想效果的情況下，也可采用三步法 PCR程序，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 熱啟動
Stage 3
40 循環(huán)
95℃ 5 s 變性
55℃ 10 s 退火
72℃ 30 s 收集信號 延伸
4. 反應(yīng)結(jié)束后確認 Real-Time PCR 的擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
注意：消化污染步驟中的溫度設(shè)置可在 25-37℃之間均可，無顯著差異，但高于 42℃以上的溫度會導(dǎo)致熱敏 UDG 消化能力急劇下降。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。