Bst 4.0 Basic Mix (液體預(yù)混)

該制品為單一組分的 MasterMix（2 倍濃度），包含了反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，使用時(shí)只需要加入引物、模板即可進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增。Bst4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴于 RNA 模板的聚合酶活性（逆轉(zhuǎn)錄），還具有依賴于 DNA 的聚合酶活性，因此無(wú)論DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進(jìn)行高效的恒溫?cái)U(kuò)增。該制品是進(jìn)行 LAMP 及 RT-LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。優(yōu)化的反應(yīng)體系，確?？焖俚耐瓿蓹z測(cè)試劑的反應(yīng)體系建立。該系列產(chǎn)品不包含任何其它輔助染料，在 LAMP 的擴(kuò)增搭配 OG 橙綠變色管進(jìn)行可視化變色反應(yīng)。除此外，該制品還可以用于其它恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)，包括 CPA、SMAP 等。
儲(chǔ)存：長(zhǎng)期保存制品于-20℃，保存 2 年。
使用實(shí)例（以 LAMP OG 橙綠變色為例）橙綠變色染料（OG Dye）以凍干的形式預(yù)加在 8 聯(lián)管蓋上。在 LAMP 反應(yīng)完畢后（在反應(yīng)完畢前，務(wù)
必不能將管蓋上染料混入反應(yīng)液中），將 0.2ml EP 管顛倒溶解 OG 染料后。LAMP 的反應(yīng)產(chǎn)物將與 OG 染料形成強(qiáng)烈的綠色肉眼可見變色反應(yīng)（陽(yáng)性），而未發(fā)生擴(kuò)增的 EP管為深橙色（陰性）。
（1）配制反應(yīng)體系
在 0.2ml EP 反應(yīng)管中加入下述試劑
2xBst 4.0 Basic Mix 10 μl
*10xLAMP Primer Mix 2 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 20 μl
*10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、LoopF/B 分別為 4 μM、F3/B3 分別為 2 μM全部試劑加入完畢后，輕彈 EP 管底部后，再蓋上 OG 橙綠變色管（蓋上管蓋后務(wù)必不能再劇烈混合與倒置，以防止將管蓋上的 OG 染料溶解，OG 染料一旦混入反應(yīng)液中將會(huì)終止 LAMP 反應(yīng)）。
實(shí)驗(yàn) LAMP Primer Mix 分別采用 1、1.5、2 μl，以陰性不變色，陽(yáng)性樣品正常變色為標(biāo)準(zhǔn)，作為后續(xù)測(cè)試用量。
（2）反應(yīng)體系配好后，置于 60~68°C（實(shí)驗(yàn)采用65°C）進(jìn)行反應(yīng) 20~45min。（擴(kuò)增良好的引物組合，通常 25min 即可變色，一般不超過(guò) 45min，實(shí)驗(yàn)設(shè)置20、25、30、45min）。
（3）觀察結(jié)果：觀察結(jié)果時(shí)，盡可能不要與配制反應(yīng)空間共用，以防止污染操作臺(tái)。將反應(yīng) EP 管倒置，并手腕輕甩，反應(yīng)液浸泡 EP 管蓋上的 OG 染料，靜置 30s。再將 EP 反應(yīng)管正置，并輕甩反應(yīng)液到 EP 管底部，此時(shí)擴(kuò)增樣品將變?yōu)轷r艷肉眼可見綠色，而陰性未發(fā)生擴(kuò)增的管將為深橙色。
注意事項(xiàng)
1. 在用于其它恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)時(shí)（如 CPA、SMAP 等），可參考如上策略進(jìn)行使用，反應(yīng)時(shí)間可能會(huì)需要調(diào)整。
2. 關(guān)于礦物油的使用，在配制完 LAMP 反應(yīng)體系后，可加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)液上部，以減少氣溶膠的污染。
3. 鑒于特殊的生產(chǎn)工藝， 全系恒溫?cái)U(kuò)增 Mix 系
列均不能進(jìn)行濁度分析。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。