單體親和素磁珠

親和素（或鏈霉親和素）和生物su之間表現(xiàn)的相互作用，是已知的非共價(jià)相互作用的一種。親和素、鏈霉親和素、 單體親和素及其類(lèi)似物已成為探針研究實(shí)驗(yàn)中強(qiáng)大的親和配體工具，被廣泛應(yīng)用于生化分析、診斷、親和純化和藥物遞送。Monomer Avidin Magnetic Beads是一種高度均勻的超順磁性微球，表面包裹著高密度的超純（>97%）亞單位單體親和素。單體親和素源自天然四聚體蛋白，它保留了與天然親和素相同的生物su結(jié)合特異性，但其生物su結(jié)合親和力會(huì)有顯著降低（kD=~10-8 M）。因此，通過(guò)使用溫和的洗脫條件，例如含有2 mM 生物su的緩沖液，就可以很容易地從單體親和素中洗脫結(jié)合的生物su化分子。本款磁珠經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)、測(cè)試和質(zhì)量控制，可用于免疫沉淀、細(xì)胞分選，以及從細(xì)胞裂 解液或雜交反應(yīng)中快速一步捕獲生物su化分子，如DNA、RNA、抗體或蛋白質(zhì)。

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產(chǎn)品特點(diǎn)：

·快捷，簡(jiǎn)單的一步法高通量操作;無(wú)需純化柱或過(guò)濾器，或重復(fù)移液、離心等操作

（圖1）

·結(jié)合能力，在溫和的條件下洗脫結(jié)合的生物su化分子

·在溫和的洗脫條件下純化生物su化樣品

·極小的非特異性結(jié)合

·對(duì)樣本體積要求低，便于自動(dòng)化操作

·成本低：只有市場(chǎng)同類(lèi)產(chǎn)品磁珠價(jià)格的一半

·磁珠至少可以重復(fù)使用5次

緩沖液

·1x PBS Buffer (0.1 M 磷酸鈉, 0.15 M 氯化鈉; pH 7 ) ·1x Regeneration Buffer (0.1 M Glycine/HCl,pH 2.8) ·1x Blocking/Elution Buffer (2 mM D-生物su溶于 PBS)

磁力分離器（適用于手動(dòng)操作）：根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)生物樣品的體積，使用者可以選擇以下不同型號(hào)的磁力分離器： 8 孔磁力架可以容納 8 個(gè)單獨(dú)的 1.5-2.0 ml 離心管 ; 24

孔磁力架可以容納 24 個(gè)單獨(dú)的 1.5-2.0 ml 離心管; 4 孔磁力-15 可以容納 4 個(gè)單獨(dú)的15ml 離心管; 4 孔磁力架-50 可以容納四個(gè)單獨(dú)的 50 ml 離心管。

操作過(guò)程

操作過(guò)程中實(shí)驗(yàn)體積可根據(jù)需要放大或者縮小

提示：在純化生物su化蛋白質(zhì)、多肽和其他分子之前。用戶(hù)應(yīng)將試劑盒中的所有試劑溫度 平衡至室溫，并用雙蒸餾水配制 1x 工作溶液。

1. 輕輕震動(dòng)裝有磁珠的試劑瓶，直到磁珠懸浮。將 50µl 磁珠轉(zhuǎn)移到新試管中。

提示：客戶(hù)應(yīng)根據(jù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)粗樣品中生物su化分子的數(shù)量，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的磁珠

使用量。過(guò)多的磁珠會(huì)導(dǎo)致背景更高；磁珠使用量少會(huì)造成產(chǎn)量降低。我們建議純化50μg 生物su化分子添加 50μl 懸浮的磁珠。

2. 將試管放在磁力分離器上1 分鐘。當(dāng)磁珠沉淀時(shí)，去除上清液。取下試管加入四倍 磁珠體積的d2H2O，充分混合。并將試管再次置于磁力分離器上1 分鐘，去除上清 液。

3. 按照步驟2 所述方式，用四倍磁珠體積的1x PBS 緩沖液清洗磁珠。

4. 加入三倍磁珠體積的1xBlocking / Elution Buffer，通過(guò)渦旋充分混合，并在室溫下培養(yǎng)5 分鐘。將試管放在磁力分離器上1 分鐘。去除上清液。

5. 加入六倍磁珠體積的1xRegenerationBuffer，通過(guò)渦漩充分混合，并將試管放在磁力分離 器上1 分鐘。去除上清液。

6. 加入四倍磁珠體積的1x PBS Buffer，并按照步驟2 所述方式清洗磁珠。這些磁珠可以隨時(shí)使用。

提示：必須立即使用磁珠，否則粘合能力將顯著降低。

7. 向磁珠中加入含有生物su化分子的樣品，通過(guò)移液器吹吸充分混合，并在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)30-60 分鐘。

8. 將試管放在磁力分離器上，保持試管留在分離器上的同時(shí)去除上清液。如步驟 2 所示， 用1x PBS 清洗磁珠，直到在280 nm 處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD280<0.05）。

9. 加入一倍磁珠體積的Blocking/Elution Buffer，通過(guò)移液器吹吸充分混合，并在室溫下培養(yǎng) 5-10 分鐘，將與磁珠結(jié)合的生物su化分子洗脫下來(lái)。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。