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稀釋法平板法分離土壤中的微生物

時間:2015-4-14閱讀:914
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目的

1.了解稀釋法分離土壤微生物的原理。

2.學(xué)習(xí)并掌握由土壤分離細(xì)菌和真菌的方法。

3,掌握有目的分離有益微生物的原理和技術(shù)。

原理

土壤是微生物棲居的大本營,各種各樣的微生物都雜居在一起。當(dāng)我們需要某種微生物時,即可通過提供適宜的營養(yǎng)條件,或添加只利于所需菌生長而抑制其它菌生長的抑制劑,有選擇地將所需菌分離出來,這種技術(shù)即稱為微生物的分離與純化。稀釋法常用于分離土壤、各種水域及基物表面的微生物。其原理是:先將土壤樣品進行一系列倍比稀釋,然后將幾個適當(dāng)濃度的稀釋液均勻涂布于分離培養(yǎng)基表面。經(jīng)培養(yǎng)后,土壤中的單個微生物細(xì)胞或孢子即可在培養(yǎng)基表面形成肉眼可見的菌落。再將所需菌落轉(zhuǎn)入試管斜面,然后經(jīng)平板劃線再次取得單菌落后,即可得到所需菌種的純菌株。因此,本方法的zui大特點是可以對土壤樣品進行活菌計數(shù),同時,如果采用選擇性培養(yǎng)基,可以分離到目的菌株。其全過程見圖24-1

本方法分離土壤微生物具有一定的局限性,首先,由于采用平板培養(yǎng),厭氧的微生物不宜在平板上生長,如果需要分離厭氧微生物,還需要厭氧操作裝置。其次,采用的幾種培養(yǎng)基不一定能適于土壤中所有的微生物生長,特別是那些目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物。本實驗選擇細(xì)菌、放線菌和真菌的zui適培養(yǎng)基,對各大類微生物進行分離和活菌計數(shù)。

本實驗還針對可以產(chǎn)生纖維素酶的微生物而設(shè)計了選擇性分離培養(yǎng)基。分別根據(jù)分離目的設(shè)計出相應(yīng)的篩選模型。制備含有不同底物的培養(yǎng)基平板,將稀釋的土壤懸液涂布,或?qū)⒎蛛x到的菌株直接點接在選擇性平板表面,置適宜溫度培養(yǎng)后,可通過肉眼觀察來判斷目的需要的目的菌株。

材料

1.樣品:過篩(孔徑約2mm)的新鮮土壤樣品(使用前先測定含水量)。

2.培養(yǎng)基:在300ml 三角瓶中分別分裝150ml 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和高氏號培養(yǎng)基。

3.選擇性培養(yǎng)基:纖維素酶產(chǎn)生菌分離培養(yǎng)基 (選做)

4.滅菌物品:250ml 三角瓶分裝90ml 無菌水(內(nèi)含20-30 粒玻璃珠),18×180mm 試管分裝9ml 無菌水,培養(yǎng)皿,1ml 吸管,玻璃刮鏟。

方法

1.制備土壤稀釋液:用小天平稱分別稱取少時潮濕的菜園土和風(fēng)干的菜園土各10g,置于90ml 含玻璃珠的無菌水中,震蕩10min,靜置30 秒后,即得土壤原液(101)。再用1ml 無菌吸管吸取1ml 上清液加到9ml 無菌水中,充分搖勻,即得(102)稀釋液。依次類推,潮濕土制得1010稀釋液; 風(fēng)干土制備1010稀釋液;

2.分離:

1)細(xì)菌的分離(基內(nèi)接種)

a..取個無菌平皿,用1ml 無菌吸管分別吸取0.1ml 1041010潮濕土的土壤稀釋液,接入平皿,每一稀釋度設(shè)個重復(fù),

b.將已融化并冷卻至45℃左右的細(xì)菌培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中,每皿約15ml,共個平皿,與菌液充分混勻,凝固后,在平皿上作好培養(yǎng)基種類、稀釋度、組號及日期標(biāo)記;

c.將平板倒置,37℃培養(yǎng)2~3 天后觀察并計數(shù)。

2)放線菌的分離(表面接種)

a.將已融化的150ml 高氏一號培養(yǎng)基中加入10%重鉻酸鉀溶液,充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中,每皿約15ml,共個平皿,凝固后,在平皿上作好培養(yǎng)基種類、稀釋度、組號及日期標(biāo)記;

b.用1ml 無菌吸管分別取0.1ml 103、1010風(fēng)干土的土壤稀釋液,接入培養(yǎng)基表面,每一稀釋度個重復(fù);

c.用無菌玻璃刮鏟,按稀釋度由高到低順序依次輕輕涂布,不要刮破培養(yǎng)基表面;

d.將平板倒置,37℃培養(yǎng)5~7 天后觀察并計數(shù)。

3)真菌的分離(表面接種)

a.將已融化的150ml PDA 培養(yǎng)基冷卻到50℃左右,加入0.3ml *溶液(1000?/ml),充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中,每皿約15ml,共個平皿,凝固后,在平皿上作好培養(yǎng)基種類、稀釋度、組號及日期標(biāo)記;

b.用1ml 無菌吸管分別取0.1ml 103、1010潮濕土的土壤稀釋液,接入培養(yǎng)基表面,每一稀釋度個重復(fù);

c.用無菌玻璃刮鏟按稀釋度由高到低順序依次輕輕涂布,不要刮破培養(yǎng)基表面;

d.將平板倒置,26~28℃培養(yǎng)天后觀察并計數(shù)。

結(jié)果

1.活菌計數(shù):

計數(shù)時通常選用每種微生物生長的zui適稀適度的三個平皿計數(shù), 如細(xì)菌、放線菌和酵母菌以每皿30~300 個菌落為宜,絲狀真菌則以每皿10~100 個菌落為宜。將原始結(jié)果填入下表,根據(jù)事先測定的土壤含水量,按公式計算出每個干土中微生物的量。


2.檢查每皿中的優(yōu)勢菌種,可根據(jù)菌落特征、制水壓片、染色制片等觀察菌體形態(tài);

3.純培養(yǎng):記錄優(yōu)勢菌株的菌落特征并編號,然后將其劃線接入試管斜面。根據(jù)已掌握的知識進行判斷,細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,放線菌用高氏一號培養(yǎng)基,真菌用PAD培養(yǎng)基。見圖24-3。分別在相應(yīng)培養(yǎng)基平板上劃線分離單菌落,待長好后再次劃線接入試管斜面,以備鑒定、保存使用。

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