作為后基因組時(shí)代出現(xiàn)的新興研究領(lǐng)域之一，蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)正受到越來越多的關(guān)注。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究目標(biāo)是對機(jī)體或細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和結(jié)構(gòu)功能分析。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究不局限任何特定的方法。高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)如二維凝膠電泳和液相層析，經(jīng)典的蛋白質(zhì)鑒定方法如氨基酸序列分析等，現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)，基因組學(xué)研究的各種手段，現(xiàn)代計(jì)算機(jī)信息學(xué)和計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)通訊技術(shù)等等，任何可用于蛋白質(zhì)研究的技術(shù)手段，蛋白質(zhì)組學(xué)都可能會采用。它體現(xiàn)的是一個(gè)開放的思維和研究方式。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用是細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)和特征。這種千變?nèi)f化的相互作用以及由此形成的紛繁復(fù)雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)同樣也是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容，相應(yīng)的工作也已經(jīng)開展。

酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)自建立以來已經(jīng)成為分析蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)有力的方法之一。該方法在不斷完善，如今它不但可用來在體內(nèi)檢驗(yàn)蛋白質(zhì)間的相互作用，而且還能用來發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)，在對蛋白質(zhì)組中特定的代謝途徑中蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識上發(fā)揮了重要的作用。實(shí)驗(yàn)表明雙雜交技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)上的應(yīng)用是成功的。本文將就雙雜交技術(shù)的產(chǎn)生、發(fā)展及其在蛋白質(zhì)組研究方面的初步應(yīng)用作一介紹。

1　蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生背景

基因組研究自從開展以來已經(jīng)取得了舉世矚目的成就。在過去幾年中，已經(jīng)陸續(xù)完成了包括大腸桿菌、釀酒酵母等十多種結(jié)構(gòu)比較簡單的生物的基因組DNA的全序列分析。線蟲(C.elegans)的基因組DNA測序工作已基本完成。規(guī)模更為龐大的人類基因組計(jì)劃預(yù)期在下一世紀(jì)的前幾年(2003～2005年)也將完成全部基因組DNA的序列分析。這些進(jìn)展是非常令人振奮的。但是也隨之產(chǎn)生了新問題。大量涌出的新基因數(shù)據(jù)迫使我們不得不考慮這些基因編碼的蛋白質(zhì)有什么功能這個(gè)問題。不僅如此，在細(xì)胞合成蛋白質(zhì)之后，這些蛋白質(zhì)往往還要經(jīng)歷翻譯后的加工修飾。也就是說，一個(gè)基因?qū)?yīng)的不是一種蛋白質(zhì)而可能是幾種甚至是數(shù)十種。包容了數(shù)千甚至數(shù)萬種蛋白質(zhì)的細(xì)胞是如何運(yùn)轉(zhuǎn)的？或者說這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)是怎樣工作、如何相互作用、相互協(xié)調(diào)的？這些問題遠(yuǎn)不是基因組研究所能回答得了的。正是在此背景下，蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)應(yīng)運(yùn)而生。

蛋白質(zhì)組(proteome)一詞是馬克.威爾金斯(Marc Wilkins)zui先提出來的，zui早見諸于1995年7月的“Electrophoresis"雜志上，它是指一個(gè)有機(jī)體的全部蛋白質(zhì)組成及其活動方式。蛋白質(zhì)組研究雖然尚處于初始階段，但已經(jīng)取得了一些重要進(jìn)展。當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)的主要內(nèi)容是，在建立和發(fā)展蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)方法的同時(shí)，進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。對蛋白質(zhì)組的分析工作大致有兩個(gè)方面。一方面，通過二維凝膠電泳得到正常生理?xiàng)l件下的機(jī)體、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的圖譜，相關(guān)數(shù)據(jù)將作為待檢測機(jī)體、組織或細(xì)胞的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫。一系列這樣的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立并且可通過聯(lián)網(wǎng)檢索。二維參考圖譜建立的意義在于為進(jìn)一步的分析工作提供基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組分析的另一方面，是比較分析在變化了的生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)組所發(fā)生的變化。如蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化，翻譯后修飾的變化，或者可能的條件下分析蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞水平上的定位的改變等。關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)的介紹可參閱文獻(xiàn)。

細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)不是雜亂無章的混合物，蛋白質(zhì)間的相互作用、相互協(xié)調(diào)是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)間的相互作用及作用方式同樣也是蛋白質(zhì)組研究所面臨的問題。研究蛋白質(zhì)間的相互作用有多種方法，常用的如酵母雙雜交系統(tǒng)、親和層析、免疫沉淀、蛋白質(zhì)交聯(lián)等。其中，酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的主要方法。

2　酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與發(fā)展

雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。80年代的工作表明，轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular)，即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain，簡稱為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，簡稱為AD)，它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的DB雖然能和啟動子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個(gè)酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點(diǎn)并激活轉(zhuǎn)錄。

Fields等人的工作標(biāo)志雙雜交系統(tǒng)的正式建立。他們以與調(diào)控SUC2基因有關(guān)的兩個(gè)蛋白質(zhì)Snf1和Snf2為模型，將前者與Gal4的DB結(jié)構(gòu)域融合，另外一個(gè)與Gal4的AD結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌"(bait)和“獵物"或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用，那么分別位于這兩個(gè)融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。這個(gè)被激活的、能顯示“誘餌"和“獵物"相互作用的基因稱之為報(bào)道基因(reporter gene)。通過對報(bào)道基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測，反過來可判別作為“誘餌"和“獵物"的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。在此Fields等人采用編碼β-半乳糖苷酶的LacZ作為報(bào)道基因，并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受Gal4蛋白調(diào)控的GAL1序列。這個(gè)改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的負(fù)調(diào)控因子)被缺失，從而排除了細(xì)胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。已經(jīng)知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有同時(shí)轉(zhuǎn)化了Snf1和Snf2融合表達(dá)載體的酵母細(xì)胞才有β-半乳糖苷酶活性，單獨(dú)轉(zhuǎn)化其中任何一個(gè)載體都不能檢測出β-半乳糖苷酶活性。

目前發(fā)展起來的各種雙雜交系統(tǒng)大多是以Fields等人建立的系統(tǒng)為基礎(chǔ)的。這些新系統(tǒng)主要對報(bào)道基因、“誘餌"表達(dá)載體以及“獵物"表達(dá)載體等做了一些改進(jìn)。其中一個(gè)重要改進(jìn)是引入額外的報(bào)道基因，如廣泛采用的HIS3基因。經(jīng)過改造帶有HIS3報(bào)道基因的酵母細(xì)胞，只有當(dāng)HIS3被啟動表達(dá)才能在缺乏的選擇性培養(yǎng)基上生長。HIS3報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是由“誘餌"和“獵物"的相互作用所啟動的。大多數(shù)雙雜交系統(tǒng)往往同時(shí)使用兩個(gè)甚至三個(gè)報(bào)道基因，其中之一是LacZ。這些改造后的基因在啟動子區(qū)有相同的轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點(diǎn)，因此可以被相同的轉(zhuǎn)錄激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。通過這種雙重或多重選擇既提高了檢測靈敏度又減少了假陽性現(xiàn)象。其他還有針對“誘餌"或“獵物"表達(dá)載體等所作的改進(jìn)，這里不一一詳述。

在雙雜交鑒定過程中要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)化，這個(gè)工作量是相當(dāng)大的，特別是尋找新的作用蛋白質(zhì)的時(shí)候尤其如此。而且，酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率比細(xì)菌要低約4個(gè)數(shù)量級。因此轉(zhuǎn)化步驟就成為雙雜交技術(shù)的瓶頸。Bendixen等人通過酵母接合型的引用，避免了兩次轉(zhuǎn)化操作，同時(shí)又提高了雙雜交的效率。在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型： a接合型和α接合型，這兩種單倍體之間接合(mating)能形成二倍體，但a接合型細(xì)胞之間或α接合型細(xì)胞之間不能接合形成二倍體。根據(jù)酵母有性生殖的這一特點(diǎn)，他們將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化α接合型酵母細(xì)胞，“誘餌"表達(dá)載體轉(zhuǎn)化a接合型細(xì)胞。然后分別鋪篩選平板使細(xì)胞長成菌苔(lawn)，再將兩種菌苔復(fù)印到同一個(gè)三重篩選平板上，原則上只有誘餌和靶蛋白發(fā)生了相互作用的二倍體細(xì)胞才能在此平板上生長。單倍體細(xì)胞或雖然是二倍體細(xì)胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。長出來的克隆進(jìn)一步通過β-半乳糖苷酶活力進(jìn)行鑒定。這項(xiàng)改進(jìn)不僅簡化了實(shí)驗(yàn)操作，而且也提高了雙雜交的篩選效率。