隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的科研人員熟練掌握了分子生物學(xué)的各種試驗(yàn)技術(shù)，并研制成套試劑盒，使基因克隆表達(dá)變得越來(lái)越容易。但分子生物學(xué)的上游工作往往并非是zui終目的，分子克隆與表達(dá)的關(guān)鍵是要拿到純的表達(dá)產(chǎn)物，以研究其生物學(xué)作用，或者大量生產(chǎn)出可用于疾病治療的生物制品。相對(duì)與上游工作來(lái)說(shuō)，分子克隆的下游工作顯得更難，蛋白純化工作非常復(fù)雜，除了要保證純度外，蛋白產(chǎn)品還必須保持其生物學(xué)活性。純化工藝必須能夠每次都能產(chǎn)生相同數(shù)量和質(zhì)量的蛋白，重復(fù)性良好。這就要求應(yīng)用適應(yīng)性非常強(qiáng)的方法而不是用能得到純蛋白的方法去純化蛋白。在實(shí)驗(yàn)室條件下的好方法卻可能在大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中失敗，因?yàn)楹笳咭笠?guī)?；以诿咳盏膽?yīng)用中要有很好的重復(fù)性。本文綜述了蛋白質(zhì)純化的基本原則和各種蛋白純化技術(shù)的原理、優(yōu)點(diǎn)及局限性，以期對(duì)蛋白純化的方法選擇及整體方案的制定提供一定的指導(dǎo)。

1、蛋白純化的一般原則

蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來(lái)得到重組蛋白。蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化階段二個(gè)階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細(xì)胞成分如DNA、RNA等分開(kāi)，由于此時(shí)樣本體積大、成分雜，要求所用的樹(shù)脂高容量、高流速，顆粒大、粒徑分布寬．并可以迅速將蛋白與污染物分開(kāi)，防止目的蛋白被降解。精細(xì)純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開(kāi)來(lái)，要用更小的樹(shù)脂顆粒以提高分辨率，常用離子交換柱和疏水柱，應(yīng)用時(shí)要綜合考慮樹(shù)脂的選擇性和柱效兩個(gè)因素。選擇性指樹(shù)脂與目的蛋白結(jié)合的特異性，柱效則是指各蛋白成分逐個(gè)從樹(shù)脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。

2、各種蛋白純化方法及其優(yōu)、缺點(diǎn)

2．1 蛋白沉淀 蛋白能溶于水是因?yàn)槠浔砻嬗杏H水性氨基酸，在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處若溶液的離子強(qiáng)度特別高或者特別低，蛋白則傾向于從溶液中析出。硫酸銨是沉淀蛋白zui常用的鹽，因?yàn)樗诶涞木彌_液中溶解性好，冷的緩沖液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸銨分餾常用作試驗(yàn)室蛋白純化的*步，它可以初步粗提蛋白質(zhì)，去除非蛋白成分。蛋白質(zhì)在硫酸銨沉淀中較穩(wěn)定，可以短期在這種狀態(tài)下保存中間產(chǎn)物，當(dāng)前蛋白質(zhì)純化多采用這種辦法進(jìn)行粗分離翻。在規(guī)模化生產(chǎn)上硫酸銨沉淀方法仍存在一些問(wèn)題，硫酸銨對(duì)不銹鋼器具的腐蝕性很強(qiáng)。其他的鹽如硫酸鈉不存在這種問(wèn)題，但其純化效果不如硫酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來(lái)，PEG是一種惰性物質(zhì)，同硫酸銨一樣對(duì)蛋白有穩(wěn)定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉淀可通過(guò)離心或過(guò)濾獲得，蛋白可在這種狀態(tài)下保存而不損壞。 蛋白沉淀對(duì)蛋白純化來(lái)說(shuō)并不是多么好的方法，因?yàn)樗荒苓_(dá)到幾倍的純化效果，而我們?cè)谶_(dá)到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質(zhì)的培養(yǎng)基及細(xì)胞裂解物中解脫出來(lái)。

2．2 緩沖液的更換 雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度，但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強(qiáng)度的緩沖液。假如你用硫酸銨將蛋白沉淀出來(lái)，毫無(wú)疑問(wèn)蛋白是處在高鹽環(huán)境中，需要想辦法脫鹽，可用的方法有利用半透膜透析，通過(guò)勤換透析液體去除鹽分，此法尚可，但需幾個(gè)小時(shí)，通常要過(guò)夜，也難以用于大規(guī)模純化中。新型的設(shè)備將透析膜夾在兩個(gè)板中間，板的一側(cè)加緩沖液，另一側(cè)加需脫鹽的蛋白溶液，并在蛋白溶液一側(cè)通過(guò)泵加壓，可以使兩側(cè)溶液在數(shù)小時(shí)內(nèi)達(dá)到平衡，若增加對(duì)蛋白溶液的壓力，還可迫使水分和鹽更多通過(guò)透析膜進(jìn)入透析液達(dá)到對(duì)蛋白濃縮的目的。也有出售的脫鹽柱，柱內(nèi)的填料是小孔徑的顆粒，蛋白分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，先于高濃度鹽離子從柱中流出，從而使二者分離。蛋白純化的每一步都會(huì)造成目的蛋白的丟失，緩沖液平衡的步驟尤甚。蛋白會(huì)結(jié)合在任何它能接觸的表面上，剪切力、起泡沫和離子強(qiáng)度的快速變化很容易讓蛋白失活。