蛋白質(zhì)磷酸化對于許多生物現(xiàn)象的引發(fā)是很必要的，包括細(xì)胞生長、增殖、泛素（ubiquitin）介導(dǎo)的蛋白降解等過程。特別是磷酸化，作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和酶活性調(diào)控的一種主要方式，通常通過引發(fā)蛋白質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)而介導(dǎo)生長因子、荷爾蒙和細(xì)胞因子等對細(xì)胞膜上受體的信號調(diào)控。

然而，磷酸化在細(xì)胞的所有磷酸化修飾中所占的比例卻非常低。大概10%的細(xì)胞蛋白會受到磷酸化共價(jià)修飾，但每100次蛋白的磷酸化修飾中僅有1次基團(tuán)的修飾。與大部分細(xì)胞中的和磷酸化水平相比，磷酸化的水平估計(jì)要低2000倍。正是由于細(xì)胞中磷酸化的水平相當(dāng)?shù)?，才能保證細(xì)胞在內(nèi)外信號的刺激下，作出靈敏的反應(yīng)，所以研究的磷酸化對于細(xì)胞信號的調(diào)控和許多重要生物現(xiàn)象的研究具有極為重要的意義，而對發(fā)生磷酸化的蛋白質(zhì)的識別及磷酸化位點(diǎn)的鑒定對揭示細(xì)胞過程的調(diào)控和藥物的作用位點(diǎn)起到非常重要的作用。

研究蛋白質(zhì)磷酸化的相關(guān)方法：

磷酸化Western Blot

對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)科研來說，抗磷酸化抗體的出現(xiàn)是一個意義重大的事件。在沒有抗磷酸化抗體之前，蛋白質(zhì)和酶的磷酸化只能通過非常危險(xiǎn)的并且很費(fèi)時(shí)的放射性實(shí)驗(yàn)來檢測。而利用抗磷酸化抗體，則可以通過Western Blot或其它免疫學(xué)方法輕松地檢測到磷酸化信號。常規(guī)的檢測方法包括：用抗磷酸化抗體在Western Blot上檢測內(nèi)源或外源表達(dá)的磷酸化蛋白。如果目標(biāo)蛋白的含量較低，也可利用免疫沉淀的方法先富集發(fā)生磷酸化的蛋白，再檢測目標(biāo)蛋白的水平?？沽姿峄贵w也常用于檢測在不同處理的條件下，細(xì)胞內(nèi)總的磷酸化水平的變化情況，作為許多細(xì)胞生物現(xiàn)象的一個重要指標(biāo)。

我們都知道如果需要檢測某一個目標(biāo)蛋白的某一特定位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)，可以選用該蛋白特定位點(diǎn)的磷酸化特異性抗體。但由于我們研究的通常是新的磷酸化位點(diǎn)，或者這些蛋白特定位點(diǎn)的磷酸化抗體效果不夠好，我們不得不自己制備磷酸化抗體。如果大家自己制備過磷酸化抗體，就會知道磷酸化抗體的制備比一般抗體的制備更加困難，而且浪費(fèi)大量寶貴時(shí)間。現(xiàn)在國外的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)可以使用通用型的磷酸化抗體，只要巧妙的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，也可以達(dá)到同樣的檢測目的。以Yuan的文章為例，他們需要檢測BCR-ABL的磷酸化，但他們沒有特異性的磷酸化抗體。他們首先使用了抗c-ABL的抗體和蛋白G-瓊脂糖珠子來免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通過Western-Blot和4G10通用型磷酸化抗體（pan-phosphotyrosine）來鑒定BCR-ABL蛋白的磷酸化水平。另外一組以Clemens為首的科學(xué)家，則利用抗Dock蛋白抗體先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10磷酸化抗體來檢測DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的磷酸化水平，通過區(qū)分這些蛋白的分子量大小，來確認(rèn)相應(yīng)的磷酸化條帶的蛋白身份。

與做普通的Western Blot相比，磷酸化Western Blot有一些要額外需要注意的事項(xiàng)：

首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，會被磷酸酶去磷酸化，所以在樣品制備和整個免疫檢測過程中，需要抑制或避免細(xì)胞內(nèi)源性和外源性的磷酸酶的干擾。針對細(xì)胞內(nèi)源性的磷酸酶，我們在樣品制備時(shí)，需要在細(xì)胞裂解液中加入足量的并且是新鮮的磷酸酶抑制劑，如PhosphoSafe 系列。外源性的磷酸酶主要是由實(shí)驗(yàn)過程中的其它試劑帶入的，比如我們要確保封閉劑中不含磷酸酶等。同時(shí)，樣品中或其它試劑中帶的細(xì)菌也會分泌外源性的磷酸酶，所以做磷酸化Western Blot的另一個關(guān)鍵是要盡量使用清潔的新鮮的溶液和新做的SDS聚丙烯酰胺凝膠，并且在樣品制備完就立刻上樣，當(dāng)天完成SDS-PAGE和Western Blot 檢測。如果要使用同一塊Blot進(jìn)行全蛋白的免疫檢測，就需要先做磷酸化的檢測再做全蛋白的檢測，以盡量避免磷酸化信號的丟失，這點(diǎn)非常重要。

有一些實(shí)驗(yàn)是用Western Blot來驗(yàn)證一組磷酸化的多肽或蛋白的存在，這時(shí)候就需要使用的通用型磷酸化抗體。因?yàn)橥ㄓ眯土姿峄贵w，如4G10磷酸化抗體，具有廣泛的識別范圍，同時(shí)具有很好的磷酸化特異性，才不會導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

以Liu的研究為例，他們就使用了通用型的抗磷酸化抗體4G10和PY20，利用Western Blot技術(shù)來驗(yàn)證其通過多肽芯片篩選出的多肽結(jié)果。他們的實(shí)驗(yàn)室是這樣設(shè)計(jì)的，首先利用磷酸化的多肽芯片（phospho-tyrosine peptide array）來篩選與SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的磷酸化多肽序列，然后對這些合成的多肽序列進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證，利用通用型的抗磷酸化抗體4G10和PY20檢測其磷酸化水平。他們發(fā)現(xiàn)不同的抗體具有很不一樣的識別特異性，如pTyr-Pro 序列能被某些SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而不被4G10和PY20識別。但就總體而言，通用型的抗磷酸化抗體可以識別絕大多數(shù)的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的磷酸化多肽，特別是4G10抗體比PY20抗體能識別更多的磷酸化多肽。

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磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)（PhosphoProteomics）：

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)類似，可以通過2D膠和質(zhì)譜MS鑒定出新的磷酸化蛋白和蛋白的新磷酸化位點(diǎn)。但是利用MS從磷酸化蛋白中檢測出磷酸化肽段會遇到許多問題，這是由于樣品中大量的非磷酸化肽段的存在使磷酸化肽段的相對濃度降低造成的。大量的非磷酸化肽段會抑制MS對磷酸化肽段的檢測，因此必須采取額外的實(shí)驗(yàn)步驟在MS之前富集磷酸化蛋白或磷酸化肽段。對此，抗磷酸化特異性抗體以及親和層析瓊脂糖珠子或柱子就能起到很好得到富集作用。特別是對于細(xì)胞中比例很低的磷酸化的研究來說，富集的過程尤顯重要。目前，通用型的抗磷酸化（pan-phosphotyrosine）單克隆抗體4G10和PY20已被證明對尋找蛋白磷酸化位點(diǎn)起到很好的作用。除此以外，也有一些通用型的抗和磷酸化的抗體如4A4，也可用于MS之前富集和磷酸化的蛋白。