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上海士鋒生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第14年

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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 維生素檢測(cè)培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測(cè)培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測(cè)培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測(cè)培養(yǎng)基 化妝品檢測(cè)培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗(yàn)培養(yǎng)基 軍團(tuán)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 支原體檢測(cè)培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測(cè)培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測(cè)培養(yǎng)基 弧菌檢測(cè)培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測(cè)培養(yǎng)基 檢測(cè)培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測(cè)培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè),增菌培養(yǎng)基
抗體
生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

western blot實(shí)驗(yàn)步驟和需要儀器

時(shí)間:2015/6/29閱讀:1050
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試劑耗材:SDS、甘油、Tris、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED,APS、、甲醇、PVDF膜、Brandford蛋白定量試劑盒、BSA、脫脂奶粉、考麻斯亮藍(lán)、麗春紅、氯化鈉、氯化鉀、DTT、ECL、顯影液、定影液等、顯影膠片。

儀器設(shè)備:超聲儀、核酸蛋白定量?jī)x、Western-blot電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、搖床、曝光合、紅燈等。

樣本準(zhǔn)備:收集106細(xì)胞,加入150μl SDS裂解液,冰上超聲5次,定量。

SDS-PAGE 電泳:

1. 準(zhǔn)備各溶液:小燒杯兩個(gè),5ml槍頭6個(gè),吸水紙,罐膠電泳設(shè)備。

2. 準(zhǔn)備罐膠槽:將玻璃板擦干凈,放入短架子內(nèi),薄板靠門,兩玻璃板及架子的底緣須在同一平面(否則漏膠);將濕潤(rùn)的墊片墊于長(zhǎng)架子上并鋪上密封膜;將短架子裝在長(zhǎng)架子上(短架子底緣須與墊片緊密接觸,否則漏膠)。

3. 準(zhǔn)備配膠。   將各溶液(ddH2O,單體,Tris-HCl,SDS,TEMED,APS)依次擺好,5ml槍頭插于長(zhǎng)罐膠槽,調(diào)好取TEMED、APS的槍。

4. 配分離膠:在一小燒杯上裝半杯ddH2O;另一小燒杯依次加上述各液(加TEMED、APS時(shí)要迅速),快速搖勻。注:膠濃度由需要檢測(cè)的蛋白大小決定。

5. 罐膠:從玻璃板中間注入膠液,注膠速度均勻,不要產(chǎn)生氣泡。罐膠后用ddH2O壓膠。

6. 等待時(shí):將Tris-HCl換成pH6.8。換取Tris-HCl及罐膠用的槍頭。調(diào)好各移液器。

7. 30分鐘后:倒掉壓膠水,用濾紙吸干殘留水,注意不要觸及膠面。

8. 配集成膠:見步驟4。

9. 罐膠:見步驟5,灌滿為止,不要有氣泡。

10. 插梳:梳柱下面不要有氣泡。

11. 等待時(shí):A---配電泳緩沖液。B---將樣本煮沸5分鐘。C---水中冷卻,短暫離心后依加樣序排放好。D---等膠近凝時(shí),將玻璃板裝在電泳架子上,罐內(nèi)槽液于槽中,檢查是否密封。E---將上槽架子按于槽中。

12. 30分鐘后:罐上槽液超過(guò)短玻璃板,拔梳(注意力道適中,不能太快)。放置上樣架子。

13. 上樣30μl:槍頭先伸入至快接近膠面時(shí)開始降將上樣液緩緩打出,使樣品液從膠面往上漲,槍頭隨液面上漲而上提??梢圆话褄ui后一滴樣品打出,但是每個(gè)樣品都須同樣處理。

14. 加外槽液。

15. 電泳。

轉(zhuǎn)膜:

1. 準(zhǔn)備:分別準(zhǔn)備泡膜和轉(zhuǎn)膜用的試劑和用具,在電泳槽中倒好轉(zhuǎn)膜液

2.揭膠:電泳結(jié)束后,將電泳槽移至水池中,倒掉電泳液,將內(nèi)槽提起放在水池邊,取出兩邊玻璃板。用純水沖干凈玻璃板,小心揭開短板,去掉集成膠,小心將膠轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)膜液在中。

3.轉(zhuǎn)膜:將夾子打開,黑色在底,依次放置海綿、濾紙、膠、膜、濾紙、海綿,關(guān)好夾子(均在液面下進(jìn)行,注意氣泡)快速放入架子中。在電泳槽中放冰袋。

4.電泳。

封閉及孵抗體:

1. 轉(zhuǎn)膜等待時(shí)   準(zhǔn)備封閉液(即Non-fat milk 5% in TBST)。

2. 轉(zhuǎn)膜完畢后,  將膜放入封閉液中,輕搖孵育1小時(shí)。

3. 孵一抗:將封閉好的膜在轉(zhuǎn)移到一抗盒子中,室溫孵育兩小時(shí)或4℃過(guò)夜,

4. 洗滌:將孵育好一抗的膜在TBST洗滌3次,每次5分鐘。

5. 孵二抗:將洗好的膜放在二抗中室溫孵育兩小時(shí)。

6. 洗滌:將孵育好二抗的膜在TBST洗滌3次,每次5分鐘。

7. ECL化學(xué)發(fā)光和曝光顯影。

western-blot凝膠濃度選擇:

15%10-45KD7.5%35-95 KD
12%12-60 KD5%55-220 KD
10%20-80 KD
 

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