與rRNA和tRNA不同的是，哺乳動物細(xì)胞的絕大部分mRNA在其3"端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纖維素親和層析法從大量的細(xì)胞RNA中分離mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在構(gòu)建cdna文庫時， 必須經(jīng)上述純化步驟制備mRNA模板。
進(jìn)行Northern雜交或Sl 核酸酶作用圖分析時，與總RNA相比，采用poly(A)+ RNA能獲得更為滿意的結(jié)果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制備oligo(dT)－纖維素，也可以買現(xiàn)成的產(chǎn)品。
1）用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纖維素。
2）將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經(jīng)用DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1m的oligo(dT)－纖維素zui大量為10mg總RNA，如果總RNA的量較少，則應(yīng)減少oligo(dT)－纖維素的使用量以防止poly(A)+RNA在過柱以及后續(xù)步驟中損失。
3）用無菌的1x層析柱加樣緩沖液沖洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x層析柱加樣緩沖液
20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
0.5mol/L NaCl
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.1％SDS
可按以下方法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液；將適量無rna酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化鈉和EDTA貯存液（參見344頁）混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高壓下蒸氣滅菌，待其次序卻至65℃左右時加入已在65℃預(yù)熱30分鐘的10 ％SDS貯存液。也可以用0.05mol/L檸檬酸鈉代替Tris.Cl 然后用DEPC處理檸檬鈉－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。
4）用滅菌水溶解RNA，于65℃溫育5分鐘后使迅速冷卻至室溫，加等體積的2x層析柱加樣緩沖液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗液。 當(dāng)所的RNA溶液均進(jìn)入柱床后，加1倍體積的1x層析柱加樣 ，繼續(xù)收集洗出液。加熱RNA可以破壞可能涉及poly(A)尾的二級結(jié)構(gòu)。
5）當(dāng)全部溶液流出后，將收集液置于65℃溫育5分鐘，重新上樣，并收集流出液。