鑒定轉(zhuǎn)基因植物的*步就是要確定被轉(zhuǎn)基因已經(jīng)穩(wěn)定的整合到了染色體上。第二步任務(wù)就是評估有多少個轉(zhuǎn)基因拷貝，以及每個轉(zhuǎn)基因的表達水平如何。一般經(jīng)過上游表達載體的設(shè)計構(gòu)建以及下游轉(zhuǎn)化體系的建立、轉(zhuǎn)化品系的篩選鑒定等一系列步驟后，即獲得 T 0 代轉(zhuǎn)基因植物。在轉(zhuǎn)化過程中，外源 DNA 隨機插入植物基因組內(nèi)，插入的拷貝數(shù)和位點都不固定。插入外源基因的拷貝數(shù)低（1或2個）能較好的表達，插入的拷貝數(shù)多則會導(dǎo)致表達的不穩(wěn)定甚至基因沉默現(xiàn)象。因此，檢測T0代轉(zhuǎn)基因植物的外源基因的拷貝數(shù)是研究其分子特性的基礎(chǔ)步驟之一。

其原理是將待測的 DNA 樣品固定在固相載體（硝酸纖維膜或尼龍膜）上，與標(biāo)記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相 DNA 的位置上顯示出雜交信號，通過檢測信號的有無、強弱可以對樣品定性、定量，從而計算出轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)。Southern法準(zhǔn)確性高、特異性強，但存在費時費力的缺點。另外，由于Southern法檢測不經(jīng)過靶片段的擴增（PCR），一般每個電泳通道需要10-30 μg的DNA，在實際操作中就需要較大量的植物材料來提取DNA，而轉(zhuǎn)基因植物的愈傷組織在無菌條件下經(jīng)過篩選、重新分化后一般都比較細(xì)弱，不宜大量取樣。如果外源基因在插入時發(fā)生基因重組，造成限制性酶切位點丟失，Southern 法也無法檢測到。這些因素都制約了Southern法在T0代轉(zhuǎn)基因植物中檢測外源基因拷貝數(shù)的應(yīng)用。

2、熒光定量PCR方法

利用新型、靈敏、高通量的實時熒光定量PCR方法可以用于測定原始品系中轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。實時熒光定量pcr技術(shù)是一種較新的DNA定量方法。其定量的基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如：SYBR GREEN I）或特異性的熒光探針（如：Taqman 探針），實時檢測熒光量的變化，獲得不同樣品達到一定的熒光信號（閾值）時所需的循環(huán)次數(shù)：CT值（Cycle Threshold）；通過將已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值與其濃度的對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以準(zhǔn)確定量樣品的濃度。熒光定量 PCR 技術(shù)具有簡便、快捷的優(yōu)點，能夠有效擴增低拷貝的靶片段DNA，對每克樣品中20 pg-10 ng的轉(zhuǎn)基因成分進行有效檢測。同時，與Southern法相比，熒光定量PCR技術(shù)可對T-DNA 的不同序列進行擴增，因此能實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因品系中的基因重組的檢測。

選擇一種合適的陽性標(biāo)準(zhǔn)品來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，是應(yīng)用實時熒光定量 PCR 技術(shù)準(zhǔn)確定量模板初始濃度的基礎(chǔ)。近年來，國內(nèi)外的科學(xué)家做了不同的嘗試。Song（2002）等認(rèn)為理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該是已插入外源基因的植物基因組DNA，并且用Southern blot準(zhǔn)確測得插入的外源基因拷貝數(shù)。但是在實際研究中，很難得到這樣一套標(biāo)準(zhǔn)品。因此，他提出替代方案，根據(jù)外源基因拷貝數(shù)和野生型植物基因組 DNA 的大小，按一定濃度比率混合，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，在轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因拷貝數(shù)研究中他們發(fā)現(xiàn)，在加入熒光染料SYBR GREEN I的20 μL PCR反應(yīng)體系中，應(yīng)以6 ng野生型玉米基因組DNA作為模板量。已知玉米基因組DNA大小為2.5 × 10.9 bp（Armuganathan和Earle 1999），相應(yīng)于6 ng的玉米基因組DNA，即可計算出模擬1、2、4、8、16個外源基因拷貝時，應(yīng)加入的質(zhì)粒 DNA 的量。

以這些梯度混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品，就可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測樣品的濃度并計算插入的拷貝數(shù)了。實驗表明，用這種方法獲得的數(shù)據(jù)和 Southern blot 的結(jié)果相當(dāng)一致。Giovanna（2002）將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因番茄作為研究材料，選擇了雙元載體T-DNA區(qū)上的兩個外源基因TSWV-N（Tomato spotted wilt virus）、nptⅡ（neomycin phosphoril-transferaseⅡ）和一個單拷貝的內(nèi)源基因（endogenous gene）作為熒光定量pcr擴增的模板，檢測外源基因拷貝數(shù)。他認(rèn)為使用植物基因組 DNA 和一定比例質(zhì)粒的混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品，會累積許多無法避免的誤差。比如使用這種標(biāo)準(zhǔn)品必需預(yù)先知道待測植物基因組 DNA 的分子量，并對植物基因組 DNA 和質(zhì)粒準(zhǔn)確定量，但在大多數(shù)情況下得到的數(shù)據(jù)都只是近似值，再以此混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品檢測每一轉(zhuǎn)基因植株的外源基因拷貝數(shù)時，就會放大這些誤差。

因此，他提出“相對CT”或“δ-δCT”的方法，這個方法的優(yōu)點是不需要為每次實驗制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，只需要一個優(yōu)化步驟證明外源基因與內(nèi)源基因有相同的，至少是相似的反應(yīng)效率即可。與其它定量技術(shù)如 Southern blot 相比，實時定量 PCR 技術(shù)的特異性和高信嗓比特性為轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)定量提供了一些方便。與實時定量 PCR 相比， DNA 點雜交技術(shù)要花費不菲的試劑、勞力以及時間。每個條帶至少需要2微克的 DNA 用于放射性檢測或是至少 10 微克用于熒光檢測，因此，需要大量的組織樣品，實驗必須等到每個植株經(jīng)過傳代能夠提供足夠數(shù)量的組織后才可以用于檢測轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。

如果存在重組的話，結(jié)果將更為復(fù)雜。定量PCR分析的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)稍高于Southern Blot的分析結(jié)果，主要原因是Southern Blot方法在同一個插入位點有多拷貝的T-DNA片段插入時，轉(zhuǎn)基因植株的基因組在*酶切時會產(chǎn)生相似的DNA片段，電泳分析時很難分辨清楚。定量PCR方法則*避免了這種情況的發(fā)生，除非目的基因DNA片段在PCR引物處發(fā)生斷裂。兩種方法分析結(jié)果的比較顯示定量PCR方法分析轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)更加有效、適用。