鑒定轉(zhuǎn)基因植物的*步就是要確定被轉(zhuǎn)基因已經(jīng)穩(wěn)定的整合到了染色體上。第二步任務(wù)就是評(píng)估有多少個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝，以及每個(gè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平如何。一般經(jīng)過(guò)上游表達(dá)載體的設(shè)計(jì)構(gòu)建以及下游轉(zhuǎn)化體系的建立、轉(zhuǎn)化品系的篩選鑒定等一系列步驟后，即獲得 T 0 代轉(zhuǎn)基因植物。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，外源 DNA 隨機(jī)插入植物基因組內(nèi)，插入的拷貝數(shù)和位點(diǎn)都不固定。插入外源基因的拷貝數(shù)低（1或2個(gè)）能較好的表達(dá)，插入的拷貝數(shù)多則會(huì)導(dǎo)致表達(dá)的不穩(wěn)定甚至基因沉默現(xiàn)象。因此，檢測(cè)T0代轉(zhuǎn)基因植物的外源基因的拷貝數(shù)是研究其分子特性的基礎(chǔ)步驟之一。

其原理是將待測(cè)的 DNA 樣品固定在固相載體（硝酸纖維膜或尼龍膜）上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相 DNA 的位置上顯示出雜交信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)信號(hào)的有無(wú)、強(qiáng)弱可以對(duì)樣品定性、定量，從而計(jì)算出轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)。Southern法準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)。另外，由于Southern法檢測(cè)不經(jīng)過(guò)靶片段的擴(kuò)增（PCR），一般每個(gè)電泳通道需要10-30 μg的DNA，在實(shí)際操作中就需要較大量的植物材料來(lái)提取DNA，而轉(zhuǎn)基因植物的愈傷組織在無(wú)菌條件下經(jīng)過(guò)篩選、重新分化后一般都比較細(xì)弱，不宜大量取樣。如果外源基因在插入時(shí)發(fā)生基因重組，造成限制性酶切位點(diǎn)丟失，Southern 法也無(wú)法檢測(cè)到。這些因素都制約了Southern法在T0代轉(zhuǎn)基因植物中檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的應(yīng)用。

2、熒光定量PCR方法

利用新型、靈敏、高通量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以用于測(cè)定原始品系中轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)是一種較新的DNA定量方法。其定量的基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如：SYBR GREEN I）或特異性的熒光探針（如：Taqman 探針），實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光量的變化，獲得不同樣品達(dá)到一定的熒光信號(hào)（閾值）時(shí)所需的循環(huán)次數(shù)：CT值（Cycle Threshold）；通過(guò)將已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值與其濃度的對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以準(zhǔn)確定量樣品的濃度。熒光定量 PCR 技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效擴(kuò)增低拷貝的靶片段DNA，對(duì)每克樣品中20 pg-10 ng的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行有效檢測(cè)。同時(shí)，與Southern法相比，熒光定量PCR技術(shù)可對(duì)T-DNA 的不同序列進(jìn)行擴(kuò)增，因此能實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因品系中的基因重組的檢測(cè)。

選擇一種合適的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，是應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)準(zhǔn)確定量模板初始濃度的基礎(chǔ)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家做了不同的嘗試。Song（2002）等認(rèn)為理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該是已插入外源基因的植物基因組DNA，并且用Southern blot準(zhǔn)確測(cè)得插入的外源基因拷貝數(shù)。但是在實(shí)際研究中，很難得到這樣一套標(biāo)準(zhǔn)品。因此，他提出替代方案，根據(jù)外源基因拷貝數(shù)和野生型植物基因組 DNA 的大小，按一定濃度比率混合，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，在轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因拷貝數(shù)研究中他們發(fā)現(xiàn)，在加入熒光染料SYBR GREEN I的20 μL PCR反應(yīng)體系中，應(yīng)以6 ng野生型玉米基因組DNA作為模板量。已知玉米基因組DNA大小為2.5 × 10.9 bp（Armuganathan和Earle 1999），相應(yīng)于6 ng的玉米基因組DNA，即可計(jì)算出模擬1、2、4、8、16個(gè)外源基因拷貝時(shí)，應(yīng)加入的質(zhì)粒 DNA 的量。

以這些梯度混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品，就可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)樣品的濃度并計(jì)算插入的拷貝數(shù)了。實(shí)驗(yàn)表明，用這種方法獲得的數(shù)據(jù)和 Southern blot 的結(jié)果相當(dāng)一致。Giovanna（2002）將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因番茄作為研究材料，選擇了雙元載體T-DNA區(qū)上的兩個(gè)外源基因TSWV-N（Tomato spotted wilt virus）、nptⅡ（neomycin phosphoril-transferaseⅡ）和一個(gè)單拷貝的內(nèi)源基因（endogenous gene）作為熒光定量pcr擴(kuò)增的模板，檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)。他認(rèn)為使用植物基因組 DNA 和一定比例質(zhì)粒的混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品，會(huì)累積許多無(wú)法避免的誤差。比如使用這種標(biāo)準(zhǔn)品必需預(yù)先知道待測(cè)植物基因組 DNA 的分子量，并對(duì)植物基因組 DNA 和質(zhì)粒準(zhǔn)確定量，但在大多數(shù)情況下得到的數(shù)據(jù)都只是近似值，再以此混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)每一轉(zhuǎn)基因植株的外源基因拷貝數(shù)時(shí)，就會(huì)放大這些誤差。

因此，他提出“相對(duì)CT”或“δ-δCT”的方法，這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要為每次實(shí)驗(yàn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，只需要一個(gè)優(yōu)化步驟證明外源基因與內(nèi)源基因有相同的，至少是相似的反應(yīng)效率即可。與其它定量技術(shù)如 Southern blot 相比，實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)的特異性和高信嗓比特性為轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)定量提供了一些方便。與實(shí)時(shí)定量 PCR 相比， DNA 點(diǎn)雜交技術(shù)要花費(fèi)不菲的試劑、勞力以及時(shí)間。每個(gè)條帶至少需要2微克的 DNA 用于放射性檢測(cè)或是至少 10 微克用于熒光檢測(cè)，因此，需要大量的組織樣品，實(shí)驗(yàn)必須等到每個(gè)植株經(jīng)過(guò)傳代能夠提供足夠數(shù)量的組織后才可以用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。

如果存在重組的話，結(jié)果將更為復(fù)雜。定量PCR分析的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)稍高于Southern Blot的分析結(jié)果，主要原因是Southern Blot方法在同一個(gè)插入位點(diǎn)有多拷貝的T-DNA片段插入時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株的基因組在*酶切時(shí)會(huì)產(chǎn)生相似的DNA片段，電泳分析時(shí)很難分辨清楚。定量PCR方法則*避免了這種情況的發(fā)生，除非目的基因DNA片段在PCR引物處發(fā)生斷裂。兩種方法分析結(jié)果的比較顯示定量PCR方法分析轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)更加有效、適用。