DNA 是生命遺傳的重要物質(zhì)，DNA 分子的定量分析和特異識別對基因組學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展具有十分重要的意義。由于生物分子自身的熒光較弱，目前多采用熒光探針法檢測。熒光探針法較傳統(tǒng)的同位素檢測速度快，重復(fù)性好，用樣量少，無輻射，在DNA 自動測序、抗體免疫分析、疾病診斷、抗癌藥物分析等方面已得到廣泛應(yīng)用[1,2]。DNA 熒光探針的靈敏度是影響檢測結(jié)果的重要因素，因而開發(fā)更靈敏的熒光探針，同時避免生物熒光背景的干擾已成為目前研究的熱點。下面對DNA 分子熒光探針的結(jié)構(gòu)、功能及對DNA 的分析應(yīng)用技術(shù)方面作一介紹。
1 吖啶、菲啶類
吖啶、菲啶類染料是應(yīng)用zui早的核酸熒光探針，它們通過嵌入或靜電吸引與DNA 分子結(jié)合，使DNA 的熒光大大增強(qiáng)，是序列非特異的小分子探針。
DNA分子熒光探針
吖啶的基本結(jié)構(gòu)為二苯并吡啶，在水溶液中呈弱堿性。1940 年，發(fā)現(xiàn)當(dāng)吖啶橙與酸性物質(zhì)連接或存在于酸性物質(zhì)中時，其特征光譜會發(fā)生一定的變化，至此一直被用于生物體的染色。吖啶橙可與DNA 或RNA 作用，與雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合后的熒光激發(fā)/發(fā)射波長分別為 502/538nm(水)[3]。為提高染料穩(wěn)定性及熒光強(qiáng)度，大量的吖啶衍生物被合成。Pavel 等[4]合成了系列硫代吖啶，并用毛細(xì)管液相色譜對其定量純化分析。Naofumi[5]合成了10-羧甲基吖啶酯，其熒光及穩(wěn)定性都有很大提高，同時含有的羧基活性基可與生物分子共價結(jié)合。Cao 等[6]在吖啶橙給體與番紅T 受體之間建立了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)定量測定DNA 的方法，其中給體的zui大發(fā)射波長要與受體的吸收波長重疊，對小牛胸腺DNA 的檢測限為2.6×10-7mol·L-1。該法雖然靈敏度較高，但易受到牛血清白蛋白和人血清白蛋白的干擾。一些吖啶的絡(luò)合物，會對小溝及DNA 序列特異識別，有望成為DNA 的轉(zhuǎn)錄抑制劑，控制核酸的表達(dá)[7,8]。對位氨基取代的喹吖啶化合物對三鏈DNA 有高度的穩(wěn)定作用及選擇性，而且該類化合物表現(xiàn)出光活性，成為DNA 的光切斷劑[9]。
溴乙錠是應(yīng)用較廣的菲啶類探針，溴乙錠可結(jié)合單鏈(ssDNA)、雙鏈及多鏈DNA，與核酸結(jié)合后，熒光增強(qiáng)20～30 倍，激發(fā)波長紅移30～40nm，發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移，Stokes 位移較大。雙嵌入劑乙錠均二聚物(Ethidium homodimer，EthD)的嵌入部分使染料分子與DNA 之間形成十分牢固的親和力，連接常數(shù)約1011(溴乙錠僅為105)，同時對三鏈DNA 有高親和作用，因而更利于應(yīng)用到抗體、抗癌藥物的基因水平的研究。Gherghi 等[10]用汞滴電極研究了溴乙錠、吖啶橙與dsDNA 的作用，結(jié)果顯示它們的作用方式*不同。利用488nm 氬離子激光激發(fā)和共聚焦熒光成像掃描系統(tǒng)對EthD 與DNA 的復(fù)合物檢測，瓊脂糖凝膠電泳后，檢測靈敏度可達(dá)pg(10-12g) 級[11]。溴乙錠探針研究dsDNA 與樹枝狀大分子(Dendrimer)的相互作用[12]，對于細(xì)胞修復(fù)、分子識別等基因生命學(xué)有深遠(yuǎn)意義。富含堿基G 的ssDNA 可以形成分子內(nèi)四鏈結(jié)構(gòu)，溴乙錠的一些衍生物可以增加DNA 四鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并作為研究四鏈結(jié)構(gòu)的熒光探針[13]。它們的一些光譜性質(zhì)見表1[3,14,15]。
DNA分子熒光探針
2 菁類染料
2.1 TOTO 類
吖啶橙、溴乙錠類染料雖然與核酸結(jié)合穩(wěn)定，但未結(jié)合的染料自身的熒光會造成高的熒光背景，干擾檢測，同時溴乙錠具有很大毒性。TOTO 和YOYO 是由Glazer 等開發(fā)的一類對dsDNA 具有高度親和力的不對稱菁染料[16,17]。染料在溶液中無熒光，降低了檢測過程中的熒光背景干擾。與dsDNA 結(jié)合后發(fā)生強(qiáng)烈的熒光，熒光增強(qiáng)約1000 倍，染料分子與DNA 的堿基對zui大比例可達(dá)1/4，在瓊脂糖凝膠和丙烯酰胺凝膠電泳中穩(wěn)定。它們分別由單體噻唑橙TO 和噁唑黃 YO 通過一個多亞甲基胺柔性鏈連接成二聚體。YOYO 是TOTO 的類似物，只是其中用苯并噁唑替換了苯并噻唑。改變多亞甲基鏈兩端的染料分子，可以得到不同的異二聚體TOTAB、TOTIN 等。該類染料還有POPO、BOBO 以及不對稱單亞甲基菁染料PO-PRO、BO-PRO、TO-PRO、 YO-PRO 等，共軛鏈碳數(shù)增加，吸收及發(fā)射波長產(chǎn)生紅移。Rye 等認(rèn)為ssDNA-TOTO 復(fù)合物穩(wěn)定性及光譜性質(zhì)的變化在于TOTO 頭部基團(tuán)與單鏈堿基之間的堆積作用和鏈上兩個陽離子正電荷與DNA 骨架上的負(fù)電荷之間的庫侖力共同作用的結(jié)果[18]。TOTO 可高選擇性地用于dsDNA 的非序列特異性的檢測，它對所有的dsDNA 表現(xiàn)出*的親和作用，但更易嵌入dsDNA 的(5"- CTAG-3")2 位，大約是100 倍的選擇性，其次是(5"-CTGA-3")2 位，大約50 倍的選擇性[19]。Jason 等[20]用溶液粘度測定法和原子力顯微鏡解釋了TOTO 與DNA 的雙嵌入作用。…………
