DNA分子水平上的多態(tài)性檢測技術(shù)是進行基因組研究的基礎(chǔ)。運用隨機引物擴增尋找多態(tài)性DNA片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，隨機擴增的多態(tài)性DNA)。盡管RAPD技術(shù)誕生的時間很短, 但由于其*的檢測DNA多態(tài)性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術(shù)已滲透于基因組研究的各個方面。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列(通常數(shù)百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性,這些擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結(jié)合位點.這些特異的結(jié)合位點在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR擴增反應(yīng)的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3"端相距在一定的長度范圍之內(nèi),就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點分布發(fā)生相應(yīng)的變化,而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。通過對PCR產(chǎn)物檢測即可檢出基因組DNA的多態(tài)性。分析時可用的引物數(shù)很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區(qū)域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測。另外，RAPD片段克隆后可作為RFLP的分子標記進行作圖分析。
在真核生物基因組中均存在著由1～4個堿基對組成的簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats）簡稱SSR,又稱之為微衛(wèi)星(Microsalite),如(GA)n、(AC)n、(GAA)n等。同一類微衛(wèi)星DNA可分布在整個基因組不同位置上,由于其重復(fù)次數(shù)不同或重復(fù)程度不*而形成每個座位的多態(tài)性。SSR兩端有一段保守的DNA序列,通過這段序列可以設(shè)計一段互補序列的寡聚核苷酸引物,對SSR進行PCR擴增,由于SSR多態(tài)性僅由簡單序列的重復(fù)次數(shù)的差異引起的,通常表現(xiàn)為共顯性。SSR擴增產(chǎn)物通常采用高濃度的瓊脂糖膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeats)是一種新型的分子標記,是于1994年創(chuàng)建的一種簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性分子標記。它的生物學(xué)基礎(chǔ)仍然是基因組中存在的SSR。ISSR標記根據(jù)植物廣泛存在SSR的特點,利用在植物基因組中常出現(xiàn)的SSR本身設(shè)計引物,無需預(yù)先克隆和測序。用于ISSR-PCR擴增的引物通常為16～18個堿基序列,由1～4個堿基組成的串聯(lián)重復(fù)和幾個非重復(fù)的錨定堿基組成,從而保證了引物與基因組DNA中SSR的5’或3’末端結(jié)合,導(dǎo)致位于反向排列,間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進行PCR擴增。SSR在真核生物中的分布是非常普遍的,并且進化變異速度非?？?因而錨定引物的ISSR-PCR可以檢測基因組許多位點的差異。有時為了增加多態(tài)性,常常采用一個SSR序列和一個隨機引物組成的引物對,這樣就又獲得了另一種與SSR相關(guān)的標記,這種標記一端可以錨定在SSR序列中,另一端則可以通過隨機引物來篩選,同一個SSR序列引物與不同的隨機引物組合,可以獲得各種各樣的組合,從而得到更多的多態(tài)性。
RAPD
一、 材料 不同來源的DNA(50ng/ul)。
二、設(shè)備
PCR儀，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，電泳裝置。
三、試劑
1、隨機引物(10mer) (5umol/L)：購買成品。
2、taq酶(5U/ul)：購買成品。
3、10xPCR 緩沖液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris•Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100。
4、MgCl2 ：25mmol/L。
5、dNTP(1mmol/L)：每種2.5mmol/L。
6、5*TBE buffer
注意：槍頭和Epp管要滅菌
四、操作前準備
1.dNTP工作液處理：
dATP（100Mm）+ dGTP（100Mm）+ dTTP（100Mm）+ dCTP（100Mm）各取出10ul混合，再從中取出4ul＋96ulH2O ，配成1mM
dNTP過夜凍融會降解，各取4種dNTP各10ul混合后作為儲液
2.DNA模板的處理：
DNA不能反復(fù)凍融，取DNA提取液5ul與H20 45ul混合，即將模板稀釋10倍，大約20ng/ul
3.引物（0.2OD）
室溫平衡2min，離心機zui高速度離心2min，加入400ul H20，充分溶解，成為5Um
4.Taq酶處理
Taq母液5u/ul稀釋5倍成為1u/ul
5.Maker處理
1ul（50ug）Maker＋1ul Loading buffer＋4ul ddH20
6.5×TBE buffer（5L）
27g Tris－base＋13.75g硼酸＋10ml 0.5mol/l EDTA(PH8.0) ＋ddH2O
五、操作步驟：
1. 在25ul反應(yīng)體系中,加入(1tube)(可以混合多管后分裝)
模板DNA（5Um） 4ul (50ng)
隨機引物(5Um) 2ul (約5pmol)
10xPCR Buffer(1*) 2.5ul
MgCl2 (25Mm) 2.5ul
dNTP(1Mm) 2.5ul
Taq酶 1單位（U） 0.2ul
加ddH2O 至 25ul ()為原濃度
混勻稍離心, 加一滴礦物油。
2. 在加熱至90℃以上的PCR儀中預(yù)變性94℃ 2分鐘, 然后循環(huán): 94℃ 1分鐘， 36℃ 1分鐘， 72℃ 2分鐘，共40輪循環(huán)。
3. 循環(huán)結(jié)束后, 72℃ 7分鐘，4℃保存。
4. 取PCR產(chǎn)物20ul加4ul上樣緩沖液 (6x)（1：5）于1.4% 瓊脂糖膠上電泳（可以不換槍頭，于緩沖液中沖洗），高壓200V 2min使樣品離孔，穩(wěn)壓60Ｖ2h（電壓低帶型整齊， 分辨率高）（小板）。
5. Maker 4ul
6. 電泳結(jié)束，觀察、拍照。
[注意] 1、電泳時一般RAPD帶有5-15條, 大小0.1-2.0kb。
2、 特異性的DNA帶可以克隆作為一個新的分子標記應(yīng)用。
ISSR
反應(yīng)體系：10xPCR Buffer 2ul
模板DNA(5Um) 4ul (50ng)
引物(5Um) 2ul (約5pmol)
MgCl2 (25Mm) 2.5ul
dNTP(1Mm) 2.5ul
Taq酶 1單位（U） 0.2ul
加ddH2O 至 20ul
ISSR-PCR設(shè)置： 94℃變性5min后，94℃變性30sec,52℃退火45sec，72℃延伸2min,共45個循環(huán)，然后72℃延伸7min,zui后將結(jié)果置于4℃冰箱中。擴增產(chǎn)物在用5×TBE配制的2.0%的瓊脂糖凝膠中電泳分離
