一、試劑

1 、 10 × TBE ( pH 8.3 )：

2 、 46% 尿素溶液：

3 、 20% 聚丙烯酰胺溶液

4 、 10% 過(guò)硫酸胺

5 、引物

6 、模板

7 、 DNA 聚合酶

8 、放射性標(biāo)記的 dNTP 和 ddNTP 貯存液

9、TEMED

二、操作方法

(一)由雙鏈質(zhì)粒制備單鏈DNA膜板

取質(zhì)粒 DNA (溶于雙離蒸去離子水中) 8μl ( 1.5 ～ 2ug )

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加 2mol NaOH 2ul ，混勻后稍加離心，置室溫 10min

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加 3mol 乙酸鈉( pH5.2 ) 3μl

雙蒸去離子水 7μl

無(wú)水乙醇 60μl

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置液氮 10min ，離心 10min ( 13krpm )，

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加 70%乙醇洗1次，離心 ( 13krpm )

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棄上清，真空抽干，溶于 10ul雙 蒸去離子水中

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取樣，電泳鑒定

(二)聚丙烯酰胺/尿素膠制備：

將玻板洗凈，拭干; 70% 乙醇洗，涼干;內(nèi)層涂硅油，

重蒸水洗凈，吹干

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混合： 20% 聚丙烯酰胺液 20ml

10 × TBE 5ml

46%尿素 25ml

總計(jì)40ml過(guò)濾紙濾過(guò)

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加 10%過(guò)硫酸胺(AP)250μl;用雙蒸去離子水定容至100ml，混勻

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倒膠前加入 TEMED 50μl，混勻

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灌膠，待凝膠聚合后，將測(cè)序膠板安裝于測(cè)序電泳槽中

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電泳槽中加入 800ml1 × TBE

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預(yù)電泳

(三)DNA序列反應(yīng)：

模板 DNA 10μl ; 4 只離心管上標(biāo)記

引物 2μl G 、 A 、 T 、 G 各管中

退火緩沖液 2μl 分別加入 2.5ul 的 ddNTP

總體積 14μl 終止混合液，蓋好蓋子。

↓ ↓

60℃ 10min 變性 37℃孵育1min

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標(biāo)記混合物 3μl

α-32P-dATP 1μl

稀釋的DNA聚合酶2μl

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混勻后置室溫5min

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每個(gè)反應(yīng)管4.5μl ↓

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37℃ 5min溫浴

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每管加入5μl 終止液

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混勻，置冰上

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上樣前75～80℃

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混勻，置冰上

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上樣前75℃～85℃加熱2min，隨即上樣

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依次為A、G、C、T，每孔上樣2～3μl

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40W恒功率下電泳，至溴酚藍(lán)走到底

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