習(xí)慣上，人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個(gè)或多個(gè)個(gè)體組成的群體。所以，從同一受精卵分裂而來(lái)的單卵雙生子（monozygotic twins）便屬于同一克隆。細(xì)胞學(xué)上，克隆是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitor cell）分裂而來(lái)的具有同一遺傳背景的子細(xì)胞群體。分子生物學(xué)上，把將外源DNA插入具有自主復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以自主復(fù)制和*保存的過(guò)程叫做分子克隆。
基因定位克隆或圖位克?。╩ap-based cloning）是用于分離其編碼產(chǎn)物尚不知道的目的基因的一種有效的方法。具體的步驟是先將目的基因，亦即目的基因的突變定位到染色體上，并在目的基因的兩側(cè)確定一對(duì)緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記；接著利用zui緊密連鎖的一對(duì)兩側(cè)分子標(biāo)記作探針，通過(guò)染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)分子標(biāo)記之間的含目的基因的特定的基因組片段克隆并分離出來(lái)；zui后是根據(jù)其同突變體發(fā)生遺傳互補(bǔ)的能力從此克隆中鑒定出目的基因。成功地應(yīng)用基因定位克隆技術(shù)分離目的基因的一個(gè)必要條件是，以酵母人工染色體YAC（yeast artificial chromosome）為載體構(gòu)建含有大片段DNA的YAC庫(kù)。另一個(gè)必要的條件是要有可用的同目的的基因緊密連鎖的DNA探針。
酵母人工染色體（yeast artificial chromosome。YAC）載體可以克隆數(shù)百kb的大分子量的dna片段。YAC載體包括如下的組成部分：
① 一段來(lái)自酵母染色體的著絲粒序列；
② 一段控制酵母DNA復(fù)制的自主復(fù)制序列（autonomously replicatimg sequence，ARS）；
③一對(duì)酵母的端粒序列，在有的YAC載體中（例如pYAC4），這對(duì)端粒序列來(lái)自四膜（Tetrahymena）染色體；
④選擇記號(hào)；
⑤克隆位點(diǎn)。
YAC載體能夠如同染色體一樣在酵母細(xì)胞中正常地復(fù)制，并可以克隆大片段的外DNA，其大小至少可相當(dāng)于zui大的酵母染色體。應(yīng)用酵母人工染色體構(gòu)建真核基因組YAC庫(kù)的基本過(guò)程如下：首先選用核酸內(nèi)切限制酶EcoRI和BamHI對(duì)YAC載體pYAC4作雙酶消化，結(jié)果兩個(gè)端粒序列之間的片段便被移走，產(chǎn)生出具有EcoRI粘性末端的兩條臂分子。在每一條臂分子中都帶有一段端粒序列和一個(gè)選擇記號(hào)。同時(shí)再選用一種切割位點(diǎn)的核酸內(nèi)切限制酶，對(duì)高分子量的真核基因組DNA作局部消化。
反應(yīng)物通過(guò)脈沖電場(chǎng)凝膠電泳或密度離心除去分子量小于200kb的DNA片段，收集剩余部分的大分子量的DNA片段，純化后與YAC臂連接?；蛘呤侵苯訌碾娪灸z中切出含有所需分子量范圍的DNA片段的膠塊，從中提取DNA，并與YAC臂連接。然后再經(jīng)過(guò)一次脈沖電場(chǎng)凝膠電泳，把含有插入序列的YAC載體分離出來(lái)，并轉(zhuǎn)化給已經(jīng)去掉了細(xì)胞壁的酵母細(xì)胞，即原生質(zhì)球。應(yīng)用存在于兩臂分子上的選擇基因（selectable genes），篩選含有YAC兩臂的酵母克隆。
一、RFLP分子標(biāo)記
所謂RFLP，即DNA限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性，它是指應(yīng)用特定的核酸內(nèi)切限制酶切割有關(guān)的DNA分子，所產(chǎn)生出來(lái)的DNA片段在長(zhǎng)度上的簡(jiǎn)單變化。由于核酸內(nèi)切限制酶是以一種序列特異的方式切割DNA分子，來(lái)自一個(gè)完整的純合子個(gè)體（所有的基因及DNA序列）的每一種同源的DNA分子，都會(huì)在同樣的位點(diǎn)被準(zhǔn)確地切割。
從不同的生態(tài)型（ecotype）或不同的地理隔離群（geographical isolate）植株分離的總DNA中，同源DNA分子通常會(huì)表現(xiàn)出序列的趨異性（divergence），形成RFLP。這些RFLP是由于DNA序列上的特定變化（突變）引起的，因此它們也能夠像其他任何遺傳標(biāo)記一樣進(jìn)行定位，成為一種十分有用的分子標(biāo)記。
RFLP作圖的原理與步驟以擬南芥菜為例，簡(jiǎn)述RFLP作圖的基本原理與步驟。將實(shí)驗(yàn)的條件限定為：兩個(gè)不同的擬南芥菜生態(tài)型，即Columbia生態(tài)型和Niederzenz生態(tài)型；兩個(gè)雜交探針，即基因A和基因B；一種核酸內(nèi)切限制酶EcoRI。從這兩個(gè)不同生態(tài)型的擬南芥菜提取的兩份總DNA，經(jīng)過(guò)EcoRI限制酶的切割和瓊脂糖凝膠電泳分部分離之后，作Southern轉(zhuǎn)移，并分別同放射性標(biāo)記的探針基因A和基因B雜交。
在圖中可以看到，兩親本生態(tài)型的DNA，同兩種探針雜交的結(jié)果都呈現(xiàn)出多態(tài)性現(xiàn)象，這說(shuō)明在這兩個(gè)生態(tài)型的不同大小的DNA限制片段上，都存在著基因A和基因B的序列。F1代是雜合子，正如我們預(yù)期的情況一樣，它含有兩親本的限制片段。由這些F1代植株自花授粉所產(chǎn)生的F2代植株中，也會(huì)出現(xiàn)這種預(yù)期的1：2：1的分離模式。這兩個(gè)基因是獨(dú)立分配還是連鎖分配，會(huì)表現(xiàn)出非常不同的結(jié)果。
目前還可用其他分子標(biāo)記如SSLP和CAPS等進(jìn)行分子作圖。
二、染色體步移
染色體步移的起點(diǎn)是具有一個(gè)與待分離的目的基因盡可能靠近的已經(jīng)鑒定的分子標(biāo)記。這種標(biāo)記可以是RFLP，也可以是已知的基因克隆。
先構(gòu)建起點(diǎn)RFLP標(biāo)記克隆的限制圖，并把其中zui靠近目的基因的限制片段亞克隆出來(lái)。此限制片段經(jīng)放射性同位素標(biāo)記之后，用作分子雜交探針，從基因組文庫(kù)中篩選與起點(diǎn)克隆具有重疊序列的新克隆（稱之為一步克?。?。重復(fù)進(jìn)行上述的各個(gè)步驟。構(gòu)建一步克隆的限制圖，亞克隆其中zui靠近目的基因的限制片段，該片段經(jīng)放射性同位素標(biāo)記之后，用作分子雜交探針從基因組文庫(kù)中篩選與一步克隆具有重復(fù)序列的新克?。ǚQ之為二步克?。?。如此重復(fù)進(jìn)行多次，每得到一個(gè)新的克隆都更接近目的基因一步，直至zui后獲得了目的基因的克隆。由于這種技術(shù)是通過(guò)逐一克隆來(lái)自染色體基因組DNA的彼此重疊的序列，而慢慢靠近目的基因，因此
